Page 153 - 《广西植物》2025年第6期
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６ 期 卢芃等: 红花檵木 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因 ＬｃＭＹＢ１１３ 调控花青苷合成 １ １ ３ ９
已经陆续克隆并鉴定了多个调控花青苷合成的 在红花檵木和白花檵木叶片中的表达情况ꎻ(３) 通
Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 转录因子ꎬ包括菊花( Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ × 过 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因在烟草中异源表达分析其是否能
ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ ) ( Ｗａｎｇ ＹＧ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ )、 牡 丹 够诱导花青苷生物合成ꎮ 通过对 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因的
(Ｐａｅｏｎｉａ)(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２ꎻＳｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２)、百合 克隆及功能研究ꎬ本研究确定 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因编码
( Ｌｉｌｉｕｍ ) ( Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１ ) 和 贴 梗 海 棠 蛋白归属于正调控花青苷合成的 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 因子ꎬ
(Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ ｓｐｅｃｉｏｓａ) ( Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２３) 等ꎬ这些 该基因的表达能够促进植物中花青苷合成结构基
Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 转录因子在花青苷生物合成中起重要 因的表达及花青苷物质的积累ꎬ这为进一步开展红
的调控作用ꎮ 例如:菊花的 ＣｍＭＹＢ９ａ 正调控花瓣 花檵木叶色育种提供理论基础ꎮ
中花青苷物质的合成ꎬ该转录因子能够结合并转
录 激 活 花 青 苷 生 物 合 成 结 构 基 因 ＣｍＣＨＳ 和 １ 材料与方法
ＣｍＤＦＲ 的启动子活性ꎬ在菊花中瞬时过表达或烟
草中稳定过表达 ＣｍＭＹＢ９ａ 基因都能诱导花青苷 １.１ 植物材料
物质 的 积 累 ( Ｗａｎｇ ＹＧ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎻ 卵 叶 牡 丹 红花檵木植株为 ６ ~ ８ 年扦插苗ꎬ白花檵木植
(Ｐａｅｏｎｉａ ｑｉｕｉ)的 ＰｑＭＹＢ１１３ 能够转录激活靶基因 株为 ６ ~ ８ 年 实 生 苗ꎬ 野 生 型 烟 草 ( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ＰｑＤＦＲ 和 ＰｑＡＮＳ 的活性ꎬ从而促进叶片花青苷物 ｔａｂａｃｕｍ)株系(Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ￣３８ꎬＷＳ３８) 及转基因烟草
质的合成ꎬ在烟草和拟南芥中异源表达 ＰｑＭＹＢ１１３ 株系盆栽于湖南工业大学百合工程研究中心植物
基因也能够促进花青苷生物合成结构基因的表达 生长室ꎬ生长条件为 ２２ ℃ 恒温ꎬ光照周期为 １６ ｈ
及 产 物 的 积 累 ( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ )ꎻ 紫 斑 牡 丹 光照、８ ｈ 黑暗ꎮ 新鲜的叶片用于直接提取花青苷
(Ｐａｅｏｎｉａ ｒｏｃｋｉｉ) 的 ＰｒＭＹＢ５ 能转录激活 ＰｒＤＦＲ 基 物质ꎬ部分新鲜叶片经液氮速冻后放置于 － ８０ ℃
因的表达并正调控花瓣中花青苷物质的合成( Ｓｈｉ 冰箱中ꎬ用于进一步的 ＲＮＡ 提取、ｃＤＮＡ 第一链合
ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２)ꎬ这与卵叶牡丹 ＰｑＭＹＢ１１３ 的功能类 成及实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 分析ꎮ
似ꎻＬｖＭＹＢ５ 是东方百合栽培品种‘ Ｖｉｖｉａｎ’ ( Ｌｉｌｉｕｍ 野生型及转基因烟草种子在培养基生长 ２ 周
ｏｒｉｅｎｔａｌ ｈｙｂｒｉｄｓ ｃｕｌｔｉｖａｒ Ｖｉｖｉａｎ) 花瓣花青苷物质合 后ꎬ移植到营养土中再继续生长约 １８ 周后ꎬ植株
成的正调控因子ꎬ抑制该基因的表达会导致百合 主花序正常开花ꎬ采集主花序向下的第 ５ 或第 ６ 片
花瓣花青苷积累减少ꎬ而烟草叶片中瞬时表达该 叶片ꎮ 一部分新鲜的叶片材料用于直接提取花青
基因会促进花青苷色素的积累( Ｙｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２１)ꎮ 苷物质ꎬ另一部分经液氮速冻后放置于 － ８０ ℃ 冰
此外ꎬ贴梗海棠( Ｃｈａｅｎｏｍｅｌｅｓ ｓｐｅｃｉｏｓａ) ( Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ 箱中ꎬ用于进一步的基因表达分析ꎮ
２０２３)、鸡爪枫(Ａｃｅｒ ｐａｌｍａｔｕｍ)( Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２)、 １.２ ＬｃＭＹＢ１１３ 克隆和遗传转化烟草
斜纹 粗 肋 草 ( Ａｇｌａｏｎｅｍａ ｃｏｍｍｕｔａｔｕｍ) ( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ 使用通用植物 ＲＮＡ 快速提取试剂盒 ＲＮ５２(北
２０２２)和月季( Ｒｏｓａ ｈｙｂｒｉｄａ) ( 李茂福等ꎬ２０２２) 等 京艾德莱生物科技有限公司) 提取红花檵木的总
观赏植物的 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢｓ 因子也被发现能够正调 ＲＮＡꎮ 使用 Ｍ￣ＭｕＬＶ 第一链 ｃＤＮＡ 合成试剂盒 [生
控花青苷物质的合成ꎮ 目前ꎬ除了在红花檵木中 工生物工程(上海)股份有限公司] 合成 ｃＤＮＡ 的第
克隆了多个花青苷生物合成途径的结构基因外 一链ꎮ 利用高保真酶 ＧＸＬ [ 宝日医生物技术( 北
(张翔ꎬ２０２０ꎻ李彩虹ꎬ２０２１)ꎬ对其生物合成调控的 京)有限公司] 扩增红花檵木 ＬｃＭＹＢ１１３( ＧｅｎＢａｎｋ
相关分子机制尚不清楚ꎬ也没有关键调控转录因 序列 号 ＯＲ３４４７５８) 的 开 放 阅 读 框 ( Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
子 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 功能的报道ꎮ ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)序列ꎬ基因特异引物见表 １ꎬ扩增体系为
本研究基于转录组测序数据克隆了红花檵木 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 体系配置如下:５×ＧＸＬ Ｂｕｆｆｅｒ １０.０ μＬꎬ
Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 家族的 １ 个 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因ꎬ对其进行生 ｄＮＴＰ Ｍｉｘｔｕｒｅ(２.５ ｍｍｏｌＬ )４.０ μＬꎬ正向、反向引
￣１
物信息学分析ꎬ构建过表达载体及遗传转化烟草ꎬ 物各 １.０ μＬꎬ第一链 ｃＤＮＡ 模板 ０.５ μＬꎬＧＸＬ 高保真
对比分析转基因和野生型烟草在表型、花青苷含 酶 １.０ μＬꎬｄｄＨ Ｏ 补充至 ５０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增程序如
２
量、花青苷合成结构基因的表达量之间的差异ꎬ拟 下:预变性 ９５ ℃ ２ ｍｉｎꎻ９８ ℃ １０ ｓꎬ５５ ℃ １５ ｓꎬ６８ ℃
探讨以下问题:(１)ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋白理化性质、结构、 １ ｍｉｎꎬ进行 ３５ 个循环ꎻ７２ ℃延伸 ５ ｍｉｎꎬ１０ ℃保存ꎮ
所属家族及物种间的进化关系ꎻ(２)ＬｃＭＹＢ１１３ 基因 ＬｃＭＹＢ１１３ ＯＲＦ 的 ＰＣＲ 产物在琼脂糖凝胶电泳及回
