Page 154 - 《广西植物》2025年第6期
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１ １ ４ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
收后ꎬ利用 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ ＩＩ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ(南京 １.４ 实时荧光定量 ＰＣＲ 检测
诺唯 赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 ) 无 缝 连 接 到 检测红花檵木 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因相对表达量的
ｐＳｕｐｅｒ１３００ 过表达载体中(荣朵艳等ꎬ２０１９)ꎮ 重组 实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 引物见表 １ꎬ内参基因选择
过表达载体 ｐＳｕｐｅｒ￣ＬｃＭＹＢ１１３ 通过热激法转化大 甘油醛￣３￣磷酸脱氢酶( Ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ￣３￣ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
肠杆菌感受态 ＤＨ５αꎬ单菌落测序正确后ꎬ提取阳性 ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅꎬＧＡＰＤＨ) ( 张 力 等ꎬ２０１３)ꎮ 同 时 订
菌的质粒ꎬ并利用液氮冻融法将质粒转化到农杆菌 购烟草花青苷生物合成结构 基 因 ( 包 括 ＮｔＡＮＳ、
ＮｔＤＦＲ、ＮｔＣＨＳ 等)及内参基因 ＮｔＡｃｔｉｎ 的实时荧光
感受态 ＥＨＡ１０５ 中ꎮ
利用农杆菌介导的叶盘法将 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因 定 量 ＲＴ￣ＰＣＲ 引 物 ( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ )ꎮ 利 用
ＦａｓｔＳｔａｒｔ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ＤＮＡ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ( 罗氏生命科
转化到 烟 草 ＷＳ３８ 中 ( Ｇａｌｌｏｉｓ ＆ Ｍａｒｉｎｈｏꎬ１９９５)ꎮ
￣１ 学公司)实时荧光定量 ＰＣＲ 检测试剂盒检测基因
转基因烟草材料在含 ２０ ｍｇＬ 的潮霉素和 ２００
ｍｇＬ 的特美汀抗性培养基中分化及生根ꎬ再移 在组织 中 的 相 对 表 达 情 况ꎮ 实 时 荧 光 定 量 ＲＴ￣
￣１
ＰＣＲ 反应体系为 ２０ μＬ:２ × Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ 混合液
栽到营养土中盆栽生长ꎮ 利用植物基因组 ＤＮＡ
１０.０ μＬꎬ 正 向、 反 向 引 物 各 １. ０ μＬꎬ 稀 释 后 的
快速提取试剂盒 [生工生物工程( 上海) 股份有限
ｃＤＮＡ 模板 ５.０ μＬꎬ去离子水补足至 ２０.０ μＬꎮ 扩
公司] 提取转基因烟草 Ｔ０ 代植株叶片的基因组
增程序如下:９５ ℃ 预变性 １０ ｍｉｎꎻ９５ ℃ １０ ｓꎬ６０ ℃
ＤＮＡꎬ 利 用 潮 霉 素 抗 性 基 因 ( Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ
１０ ｓꎬ７２ ℃ １０ ｓꎬ共 ４０ 个循环ꎮ 每个反应设 ３ 次重
ｐｈｏｓｐｈｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅꎬＨＹＧ)、ＬｃＭＹＢ１１３ 基因的鉴定引
－△△Ｃｔ 法计算基因的
复ꎮ 利用 Ｅｘｃｅｌ ２０１０ 软件和 ２
物(表 １ꎬ转基因鉴定引物) 进行 ＰＣＲ 鉴定并获得
相对表达量ꎬ用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９.５ 软件进行柱形
阳性苗ꎬ继续养护至开花、收获种子ꎮ 选取 ３ 个具
图的绘制ꎮ 进行红花檵木叶片中基因相对表达量
有代表性表型的转基因株系 Ｔ０ 代种子ꎬ经过含潮
分析时ꎬ以白花檵木叶片中对应基因的表达量为
霉素培养基筛选后ꎬ将 Ｔ１ 代转基因阳性幼苗移植
单位 １ 进行计算ꎻ进行转基因烟草叶片中相关基
于营养土中继续生长ꎬ直至主花序正常开花ꎬ用于
因的相对表达量分析时ꎬ以野生型烟草叶片中对
进一步的取样分析ꎮ 代表性转基因植株的叶片在
应基因的表达量为单位 １ 进行计算ꎮ 利用 ＳＰＳＳ
早期生长阶段局部出现斑点状的色素积累ꎬ随着
２０ 软件及 Ｔ 检验以确定基因表达量的差异性ꎮ 不
生长时间的增加ꎬ色素斑点不断增加并连成片ꎬ叶
同的材料分别选取 ３ 个独立植株的叶片提取 ＲＮＡ
片大部分面积最终表现为紫红色ꎮ 利用转基因鉴
并进行后续实时定量分析ꎬ通过 ３ 次生物学重复
定引物对 ３ 个选定的转基因株系中 ＬｃＭＹＢ１１３ 基
确定数据的可靠性ꎮ
因的表达进行半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ内参基因选择
１.５ 花青苷含量测定
ＮｔＡｃｔｉｎ(ＧｅｎＢａｎｋ 序列号:ＬＯＣ１０７８３１１４５)ꎮ
红花檵木和白花檵木的叶片、烟草叶片的花
引物序列由生工生物工程( 上海) 股份有限公
青苷提取及含量测定用盐酸乙醇方法( 李长江ꎬ
司合成(表 １)ꎮ ２０１８)进行ꎮ 具体操作如下:剪取相应组织新鲜材
１.３ 生物信息学分析 料叶片ꎬ在分析天平上进行称重ꎬ约 ２０ ｍｇꎻ将样品
利用 ＤＮＡＭＡＮ６. ０ 软件对 ＬｃＭＹＢ１１３ 基 因 进
放入石英研钵中ꎬ同时加入 ４ ｍＬ 的提取液(０.１
行 序 列 分 析ꎬ 利 用 ＢＬＡＳＴＰ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｍｏｌＬ 的盐酸乙醇溶液) 进行充分研磨ꎬ将研磨
￣１
ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ＢＬＡＳＴ / ) 进行同源蛋白搜索ꎬ并利用
后的溶液转至 １５ ｍＬ 离心管中ꎬ将离心管在 ９５ ℃
Ｍｅｇａ５ 软件及邻接法进行系统进化树的构建ꎬ并进 水浴锅中加热 ５ ｍｉｎꎬ在 ２８ ℃ 的黑暗条件下过夜
行了 １ ０００ 次重复的 ｂｏｏｔｓｔｒａｐ 测试ꎮ 运用在线网 孵育ꎻ室温离心机 １ ０００ ｇ 离心 １ ｍｉｎꎬ取出上清
站 ＩｎｔｅｒＰｒｏ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｅｂｉ. ａｃ. ｕｋ / ｉｎｔｅｒｐｒｏ / ) 对蛋 液ꎬ用 紫 外 分 光 光 度 计 测 定 ＯＤ 值 ( ＯＤ 与
５３０
白的 保 守 结 构 域 进 行 预 测ꎮ 运 用 在 线 网 站 ＯＤ )ꎻ根据 [( ＯＤ － ０.２５ ×ＯＤ ) ×Ｖ( ｍＬ)] / ｍ
６５０ ５３０ ６５０
ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 对 (ｇ) 公式计算样品中的花青苷含量ꎬ单位为 μｇ
￣１
蛋白的理化性质进行预测ꎮ 利用在线网站 ＳＷＩＳＳ￣ ｇ ＦＷꎮ 共进行 ３ 个独立株系的叶片花青苷物质的
ＭＯＤＥＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ) 对蛋白质 测定ꎬ并用于进一步数据分析ꎬ用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ
的三级结构进行预测ꎮ ９.５ 软件进行柱形图的绘制ꎬ 利用 ＳＰＳＳ ２０ 软件及
