Page 155 - 《广西植物》2025年第6期

６ 期 卢芃等: 红花檵木 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因 ＬｃＭＹＢ１１３ 调控花青苷合成 １ １ ４ １

表 １ 基因克隆、表达分析引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
注释 基因 引物序列 ( ５′→３′ )
Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ( ５′→３′ )
基因克隆 ＬｃＭＹＢ１１３ Ｆ:ＣＣＡＡＡＴＣＧＡＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＡＴＣＣＧＡＡＴＧＴＡＣＡＣＣＡＡꎻ
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｅ Ｒ:ＴＣＧＡＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣＧＣＡＴＴＴＡＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡ
转基因鉴定 ＮｔＡｃｔｉｎ Ｆ:ＡＧＧＣＴＧＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＴＡＴＧꎻ Ｒ:ＧＡＣＴＣＡＴＣＧＴＡＣＴＣＡＣＣＣＴＴＴＧ
Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＬｃＭＹＢ１１３ Ｆ:ＴＧＧＴＡＴＣＧＣＡＴＴＣＣＡＣＴＣＡꎻ Ｒ:ＴＣＣＡＧＣＣＧＣＴＣＴＧＴＡＧＧＴＴ
ＨＹＧ Ｆ:ＴＡＣＡＣＡＧＣＣＡＴＣＧＧＴＣＣＡＧＡꎻ Ｒ:ＣＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＧＧＴＣＡＡＴＡＣＡＣ
实时荧光定量 ＲＴ￣ＰＣＲ ＬｃＭＹＢ１１３ Ｆ:ＡＴＣＴＣＣＡＴＡＧＴＣＴＣＣＡＣＴＣＴＣＣꎻ Ｒ:ＡＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣＧＣＣＡＡＡＴＣ
Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ
ＬｃＧＡＤＰＨ Ｆ:ＴＴＧＧＣＡＴＣＧＴＴＧＡＧＧＧＴＣＴꎻ Ｒ:ＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＡＣＧＧＡＡＡＧＣ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
ＮｔＣＨＳ Ｆ:ＴＧＡＣＡＣＣＣＡＣＴＴＧＧＡＴＡＧＴＴＴＡＧꎻ Ｒ:ＣＧＡＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＴＧＧＡＴＣＡＧ
ＮｔＦ３Ｈ Ｆ:ＣＣＧＡＣＣＴＴＡＣＣＣＴＴＧＧＡＣＴＧꎻ Ｒ:ＴＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＡＣＴＧＣＴＴＧＡ
ＮｔＦ３′Ｈ Ｆ:ＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＴＴＣＴＣＧＴꎻ Ｒ:ＣＡＴＣＡＡＣＴＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴ
ＮｔＤＦＲ Ｆ:ＡＡＣＣＡＡＣＡＧＴＣＡＧＧＧＧＡＡＴＧꎻ Ｒ:ＴＴＧＧＡＣＡＴＣＧＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧ
ＮｔＡＮＳ Ｆ:ＴＧＧＣＧＴＴＧＡＡＧＣＴＣＡＴＡＣＴＧꎻ Ｒ:ＧＧＡＡＴＴＡＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＴＧＣ
ＮｔＡｃｔｉｎ Ｆ:ＡＴＧＡＧＴＴＧＣＧＴＧＴＴＧＣＴＣＣＴꎻ Ｒ:ＴＡＣＣＴＧＴＴＧＴＡＣＧＧＣＣＡＣＴＧ

Ｄｕｎｃａｎ 氏方法进行不同材料之间花青苷含量的显
著差异性分析ꎮ

２ 结果与分析

２.１ ＬｃＭＹＢ１１３ 基因克隆及生物信息学分析
基于转录组测序结果ꎬ设计基因扩增特异引
物ꎬ以 红 花 檵 木 叶 片 的 ｃＤＮＡ 为 模 板 ＰＣＲ 扩 增
ＬｃＭＹＢ１１３ 基因的 ＯＲＦ 序列( 图 １)ꎮ 测序结果表
明ꎬＬｃＭＹＢ１１３ 的 ＯＲＦ 为 ７８９ ｂｐꎬ编码 ２６２ 个氨基
酸ꎮ 利用 Ｐｒｏｔｐａｒａｍ 在线分析 ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋白的理
化性质ꎬ预测出该蛋白分子量为 ３０ １２５.５５ ｋＤａꎬ分 Ａ. 红花檵木总 ＲＮＡ(Ｍ. ＤＬ５０００ ｍａｒｋｅｒ)ꎻ Ｂ. ＬｃＭＹＢ１１３ 基
因扩增ꎮ
子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ亮氨酸( ｌｅｕｃｉｎｅꎬＬｅｕ)
１３２６ ２１２５ ３８９ ３８９ １２ Ａ. Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｌｏｒｏｐｅｔａｌｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｖａｒ. ｒｕｂｒｕｍ (Ｍ. ＤＬ５０００
含量最高(占 １１.１％)ꎬ组氨酸( ｈｉｓｔｉｄｉｎｅꎬＨｉｓ) 含量 ｍａｒｋｅｒ)ꎻ Ｂ. Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬｃＭＹＢ１１３ ｇｅｎｅ.
最低(占 １.５％)ꎬ等电点为 ９.２ꎬ呈碱性ꎬ不稳定系 图 １ 红花檵木总 ＲＮＡ 及 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因扩增
数 为 ３９. ３ꎬ 疏 水 性 为 －０.５７８ꎬ 是 负 值ꎬ 表 明 Ｆｉｇ. １ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ Ｌｏｒｏｐｅｔａｌｕｍ ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｖａｒ.
ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋白是碱性且不稳定的疏水蛋白ꎮ 利 ｒｕｂｒｕｍ ａｎｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＬｃＭＹＢ１１３ ｇｅｎｅ

用 ＳＷＩＳＳＭＯＤＥＬ 在线软件ꎬ以拟南芥 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ
蛋白 ＡｔＷＥＲ 为模板构建了 ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋白 Ｒ２Ｒ３ 及保守结构域分析ꎬ结果如图 ３ 所示ꎮ ＬｃＭＹＢ１１３
结构 域 的 三 级 结 构ꎬ ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋 白 与 拟 南 芥 的 Ｎ 端含有典型的 Ｒ２Ｒ３ ＤＮＡ 识别结构域ꎬ其中
ＡｔＷＥＲ 蛋白的 Ｒ２Ｒ３ 结构域氨基酸序列一致性达 Ｒ３ 结构域中还包含 １ 个与 ｂＨＬＨ 结合识别的 [Ｄ /
到 ６２.３９％ꎬ并且 Ｒ２ 和 Ｒ３ 结构域各有 ３ 个 α 螺旋 Ｅ]Ｌｘ [Ｒ / Ｋ] ｘ Ｌｘ Ｌｘ Ｒ 基序ꎮ 此外ꎬ还发现了与
２ ３ ６ ３
(图 ２)ꎮ 花青苷合成调控相关的 ＡＮＤＶ 和 [ Ｋ / Ｒ] Ｐ[ Ｑ / Ｒ]
将 ＬｃＭＹＢ１１３ 氨 基 酸 序 列 在 ＮＣＢＩ 中 进 行 Ｐ[Ｑ / Ｒ] 特征基序ꎮ
ＢＬＡＳＴＰ 搜索ꎬ并进行同源氨基酸序列的多重比对 利用 Ｍｅｇａ５ 对包括 ＬｃＭＹＢ１１３ 在内的多种植