Page 156 - 《广西植物》2025年第6期
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１ １ ４ ２ 广 西 植 物 ４５ 卷
ＤＮＡ 回收试剂盒将 ＰＣＲ 产物进行纯化与回收ꎬ并
与线性化的 ｐＳｕｐｅｒ１３００ 过表达载体相连接ꎬ得到
的重组载体转化大肠杆菌感受态 ＤＨ５α 及测序正
确ꎮ 构建的重组载体转化至 ＥＨＡ１０５ 感受态菌株
中ꎬ利用基因 ＯＲＦ 扩增引物对单菌落进行 ＰＣＲ 验
证ꎮ 结果(图 ６) 表明ꎬ所获得的 ＰＣＲ 产物大小与
预期长度一致ꎬ表明过表达载体的成功构建ꎮ
２.４ 遗传转化烟草和转基因株系表型分析
为了确定 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因能够调控花青苷物
质的合成ꎬ将 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因构建到过表达载体
图 ２ ＬｃＭＹＢ１１３ 蛋白 Ｒ２Ｒ３ 结构域的三级结构预测
上ꎬ并利用农杆菌介导的叶盘法ꎬ将 ＬｃＭＹＢ１１３ 基
Ｆｉｇ. ２ Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｒ２Ｒ３
因转入烟草基因组中( 图 ７:Ａ－Ｆ)ꎬ对获得的转基
ｄｏｍａｉｎ ｉｎ ＬｃＭＹＢ１１３ ｐｒｏｔｅｉｎ
因株系进行 ＰＣＲ 扩增鉴定ꎬ表明潮霉素抗性基因
ＨＹＧ 和 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因均整合到 １３ 个 Ｔ０ 代转基
物 ＭＹＢ 氨基酸序列进行系统进化树构建ꎬ结果如
因株系的基因组中(图 ８)ꎮ ３ 个代表性 Ｔ１ 代转基
图 ４ 所示ꎬ红花檵木 ＬｃＭＹＢ１１３ 与来源于木本植物
因烟草株系的叶片( 图 ９:Ａ)、花朵( 图 ９:Ｃ) 等组
的 牡 丹 ( Ｐａｅｏｎｉａ × ｓｕｆｆｒｕｔｉｃｏｓａ ) ＰｓＭＹＢ１１４ 和
织中均能够观察到花青苷物质的积累ꎮ 半定量
ＰｓＭＹＢ５８ 聚 为 一 类ꎬ 并 且 与 草 本 植 物 拟 南 芥
ＲＴ￣ＰＣＲ 检测结果也表明ꎬＬｃＭＹＢ１１３ 基因的转录
( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ) 的 ＡｔＭＹＢ１１３、 矮 牵 牛
本在这 ３ 个 Ｔ１ 代转基因株系中正常表达( 图 ９:
(Ｐｅｔｕｎｉａ × ｈｙｂｒｉｄａ)的 ＰｈＡＮ２ 等的亲缘关系较近ꎬ
Ｂ)ꎮ ３ 个代表性 Ｔ１ 代转基因株系的叶片中花青
它们同属于调控花青苷合成的 ＭＹＢ 转录因子ꎬ暗
苷含量分别为( １８７ ± １６)、( ３０９ ± １０)、( ２４５ ± ３５)
示这些 ＭＹＢ 转录因子在花青苷的合成中可能具
μｇｇ ＦＷꎬ均远高于野生型烟草叶片花青苷的含
￣１
有相似的促进作用ꎮ
量(１９±２) μｇｇ ＦＷ( 图 ９:Ｄ)ꎮ 进一步对不同
￣１
２.２ 红 花 檵 木 和 白 花 檵 木 叶 片 花 青 苷 含 量 及
Ｔ１ 代转基因株系叶片花青苷生物合成结构基因的
ＬｃＭＹＢ１１３ 基因表达分析 表达进 行 分 析ꎬ３ 个 代 表 性 转 基 因 株 系 中 包 括
红花檵木是白花檵木的变种ꎬ其叶片中都能 ＮｔＡＮＳ、ＮｔＤＦＲ、ＮｔＣＨＳ、ＮｔＦ３Ｈ、ＮｔＦ３′Ｈ 等多个花青
够显著积累花青苷物质(图 ５:Ａ)ꎮ 通过对红花檵
苷生物合成结构基因的表达量显著升高( 图 １０)ꎮ
木和白花檵木的叶片中花青苷物质进行提取分 其中ꎬ２ 号 转 基 因 株 系 叶 片 中 ＮｔＤＦＲ、 ＮｔＡＮＳ 和
析ꎬ红花檵木的叶片中花青苷物质含量为(１８０±６) ＮｔＦ３′Ｈ 的相对表达量为野生型株系的 ２００ 倍以
μｇｇ ＦＷꎬ显著高于白花檵木叶片中的花青苷物
￣１
上ꎬ受到的 诱 导 表 达 最 为 明 显ꎮ 上 述 结 果 表 明ꎬ
质含量[(２４±２) μｇｇ ＦＷ] ( 图 ５:Ｂ)ꎮ 对红花 ＬｃＭＹＢ１１３ 能够促进烟草中花青苷生物合成结构
￣１
檵木及白花檵木叶片中的 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因的相对 基因的表达及花青苷物质的积累ꎮ
表达量进行检测ꎬ发现 ＬｃＭＹＢ１１３ 在红花檵木叶片
中的相对表达量是白花檵木的 １０１ 倍( 图 ５:Ｃ)ꎮ ３ 讨论与结论
这表明 ＬｃＭＹＢ１１３ 在红花檵木与白花檵木叶片中
的表达趋势与其花青苷含量的趋势相一致ꎮ 本研究基于转录组测序结果ꎬ从红花檵木中
２.３ 基因克隆及过表达载体构建 分离得到了 １ 个 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 基因 ＬｃＭＹＢ１１３ꎬ该基
为深入探究 ＬｃＭＹＢ１１３ 基因的功能特性ꎬ本研 因编码 ２６２ 个氨基酸ꎬＬｃＭＹＢ１１３ 的 Ｎ 端具有保守
究从红花檵木组织中提取总 ＲＮＡ( 图 １:Ａ)ꎬ再利 的 Ｒ２Ｒ３ ＤＮＡ 结合域ꎬ三级结构预测表明其与拟
用 逆 转 录 酶 将 ＲＮＡ 逆 转 录 为 ｃＤＮＡꎮ 利 用 南芥 ＡｔＷＥＲ 的 Ｒ２Ｒ３ 结构域相似ꎬ均由 ２ 组各 ３
ＬｃＭＹＢ１１３ 基因 ＯＲＦ 序列的特异性引物ꎬ通过 ＰＣＲ 个 α 螺旋构成ꎬ 已经证实 ＡｔＷＥＲ 的 Ｒ２Ｒ３ 结构域
技术 成 功 克 隆 得 到 目 的 长 度 约 为 ８００ ｂｐ 的 能够特异结合靶 ＤＮＡ 序列(Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２０)ꎬ推
ＬｃＭＹＢ１１３ 基因片段( 图 １:Ｂ)ꎮ 利用琼脂糖凝胶 测 ＬｃＭＹＢ１１３ 的 Ｒ２Ｒ３ 结构域也具备识别特异靶
