Page 123 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 陈玮玥等: 星油藤细胞分裂素反应调节子基因 ＰｖｏＲＲ２２ 克隆及表达分析 １ ３ １ ５

决定基因ꎮ 廖礼昱(２０２３) 发现油桐 ＶｆＲＲ２２ 在油 １.３ 星油藤 ＰｖｏＲＲ２２ 基因的克隆
桐雌雄花发育的早期发挥作用ꎬ并且其在外源 ６￣ 根据搜索获得的 ＰｖｏＲＲ２２ 序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ
ＢＡ 处理后的 ３ ｈ 和 １２ ｈ 表达量显著上调并在 １２ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５. ０ 软 件 设 计 扩 增 ＰｖｏＲＲ２２ 编 码 序 列
ｈ 达到峰值ꎬ通过构建 ＶｆＲＲ２２ 过表达载体并转化 (ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ＣＤＳ) 和荧光定量引物( 表 １)ꎮ
拟南芥和烟草ꎬ外源 ６￣ＢＡ 处理转基因植株后发现 采用 Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ￣Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ(南
其花发育异常ꎬ种子数量减少ꎮ 因此ꎬＲＲ２２ 具有 京诺唯赞生物科技股份有限公司) 扩增 ＰｖｏＲＲ２２
重要的生物学功能且在不同物种中呈现功能的多 的 ＣＤＳ(去除终止密码子)ꎬ扩增产物经 １.２％琼脂
样性ꎬ星油藤中的 ＲＲ２２ 在其生长发育过程中发挥 糖凝胶电泳检测后进行切胶回收ꎬ利用同源重组
着怎样的功能值得进一步研究ꎮ 本研究通过对星 方法构建至 ｐＯＣＡ３０￣ＧＦＰ 载体ꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ￣
油藤 基 因 组 和 转 录 组 数 据 库 进 行 检 索ꎬ 获 得 ５α 感受态细胞ꎬ挑取阳性克隆提取质粒送至生工
ＡＲＲ２２ 的同源基因并命名为 ＰｖｏＲＲ２２ꎬ并对其进行 生物工程(上海)股份有限公司测序ꎮ
基因克隆、生物信息学分析、亚细胞定位、启动子 １.４ ＰｖｏＲＲ２２ 的生物信息学分析
序列分析、启动子序列可能被结合的转录因子预 利 用 Ｅｘｐａｓｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ.
测及在不同组织部位和 ６￣ＢＡ 处理的花序芽中的 ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 预测 ＰｖｏＲＲ２２ 的理化性质ꎬ利用
Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / ) 预 测
表达分析ꎬ初步了解 ＰｖｏＲＲ２２ 可能参与星油藤生
长发育调控方面和是否响应细胞分裂素处理ꎬ为 ＰｖｏＲＲ２２ 蛋白的亲疏水性ꎬ利用 ＳＯＰＭＡ( ｈｔｔｐｓ: / /
ｎｐｓａ.ｌｙｏｎ. ｉｎｓｅｒｍ. ｆｒ) 预测 ＰｖｏＲＲ２２ 蛋白的二级结
后续其基因功能研究奠定基础ꎮ
构ꎮ 不同植物的蛋白同源性分析相关序列来源于
１ 材料与方法 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ( ｈｔｔｐｓ: / / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / )ꎬ用
ＤＮＡＭＡＮ 软件进行序列比对ꎬ利用 ＭＥＧＡ ７.０ 软
件的邻接法(Ｎ￣Ｊ 法)构建系统进化树ꎮ
１.１ 植物材料和处理
１.５ ＰｖｏＲＲ２２ 的亚细胞定位
以种植在云南省勐腊县中国科学院西双版纳
利 用 Ｐｌａｎｔ￣ｍＰｌｏｃ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｓｂｉｏ. ｓｊｔｕ.
热带植物园星油藤基地的星油藤植株为实验材
ｅｄｕ.ｃｎ / ｂｉｏｉｎｆ/ ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ) 预测 ＰｖｏＲＲ２２ 的亚细胞
料ꎬ分别采集其根、茎、茎尖、叶片、花序和幼果组
定位ꎮ 将构建好的质粒 ３５Ｓ::ＰｖｏＲＲ２２￣ＧＦＰ 转化
织ꎮ 参照 Ｆｕ 等(２０１４) ６￣ＢＡ 处理花序芽的方法ꎬ
农杆菌 ＧＶ３１０１ 感受态细胞ꎬ挑取阳性菌落 ＰＣＲ
采用 ２０ ｍｇＬ ６￣ＢＡ 处理生长在星油藤嫩茎枝上
￣１
鉴定后ꎬ扩大培养至菌液 ＯＤ ＝ １.０ꎬ收集菌体ꎬ加
６００
长约 ０.５ ｃｍ 的花序芽ꎬ分别于处理后 ０、２、４、８、 ￣１
入 １０ ｍＬ 烟 草 注 射 液 [ １０ ｍｍｏｌ Ｌ ＭＥＳ ( ｐＨ
１２、２４、３６、４８ ｈ 采集花序芽样品ꎬ每个样品 ３ 个生
５.７)和 １０ ｍｍｏｌＬ ＭｇＣｌ ]ꎬ悬浮沉淀ꎬ加入终浓
￣１
２
物学重复ꎬ液氮速冻后贮存于 － ８０ ℃ 冰箱备用ꎮ
度为 １５０ μｍｏｌＬ 乙酰丁香酮溶液ꎬ混合均匀ꎬ室
￣１
本文亚细胞定位实验所使用的烟草为本氏二倍体
温静止 ３０ ｍｉｎꎬ用注射器吸取菌液注射烟草叶片ꎬ
野生型( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)ꎬ种子由本实验室 于黑暗湿润环境中培养 ４８ ｈꎬ取叶片 ＤＡＰＩ 染色
保存ꎮ 后ꎬ采用 激 光 共 聚 焦 显 微 镜 观 察 细 胞 核 和 绿 色
１.２ ＲＮＡ 提取及 ｃＤＮＡ 合成
荧光ꎮ
采用 ＥＡＳＹｓｐｉｎ Ｐｌｕｓ 多糖多酚 / 复杂植物 ＲＮＡ １.６ ＰｖｏＲＲ２２ 的启动子序列分析及上游转录因子
快速提取试剂盒(北京艾德莱生物有限公司) 提取 预测
星油藤样品总 ＲＮＡꎬ具体操作步骤参照说明书ꎬ用 在星油藤本地基因组数据库中ꎬ提取 ＰｖｏＲＲ２２
ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｏｎｅ 分光光度计 [ 赛默飞世尔科技( 中 基因起始密码子 ＡＴＧ 上游１ ５００ ｂｐ 的启动子序
国)有限公司] 和 １.２％琼脂糖凝胶电泳检测 ＲＮＡ 列ꎬ在 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 在 线 网 站 上 进 行 分 析ꎮ 利 用
的质量和完整性ꎬ提取的 ＲＮＡ 于－８０ ℃ 冰箱保存ꎮ ＰｌａｎｔＲｅｇＭａｐ 预测可能结合 ＰｖｏＲＲ２２ 启动子序列
使用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 反转录试剂盒 的转录因子ꎮ
[宝日医生物技术( 北京) 有限公司]ꎬ具体操作参 １.７ 实时荧光定量 ＰＣＲ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)
照说明书ꎬ将 ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎮ 以星 油 藤 不 同 组 织 和 ６￣ＢＡ 处 理 花 序 芽 的