Page 124 - 《广西植物》2025年第7期

１ ３ １ ６ 广 西 植 物 ４５ 卷
ｃＤＮＡ 为模板ꎬ采 用 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 技 术 分 析 ＰｖｏＲＲ２２ ｑＰＣＲ ＳｕｐｅｒＭｉｘ Ｐｌｕｓ １０ μＬꎬＲＮＡａｓｅ ｆｒｅｅ Ｈ Ｏ ７ μＬꎬ
２
基因的相对表达量ꎬ以 ＰｖｏＧＡＰＤＨ 作为内参基因ꎬ Ｐｒｉｍｅｒ Ｆ １ μＬꎬＰｒｉｍｅｒ Ｒ １ μＬꎬｃＤＮＡ １ μＬꎮ 反应程
每个样品 ３ 个技术重复ꎮ 所用仪器为 Ｒｏｃｈｅ Ｌｉｇｈｔ 序:９５ ℃ ３ ｍｉｎꎬ９５ ℃ ３ ｓꎬ６５ ℃ １５ ｓꎬ７２ ℃ １５ ｓꎬ
®
Ｃｙｃｌｅｒ ４８０ꎬ反应体系(２０ μＬ):２×ＮｏｖｏＳｔａｒｔ ＳＹＢＲ ４０ 个循环ꎮ 实验结果采用 ２ －ΔΔＣｔ 法进行计算ꎮ
表 １ 本文使用的引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ

用途 引物名称 引物序列 (５′－３′)
Ｕｓａｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′)
构建 ３５Ｓ::ＰｖｏＲＲ２２￣ＧＦＰ 载体 ＰｖｏＲＲ２２ ＧＦＰ￣Ｆ ＴＴＴＴＣＴＴＣＧＧＡＧＣＴＴＴＴＣＧＣＧＡＧＣＴＣＡＴＧＡＣＴＡＴＧＡＧＴＴＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣＡＡ
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ３５Ｓ::ＰｖｏＲＲ２２￣ＧＦＰ ｖｅｃｔｏｒ ＰｖｏＲＲ２２ ＧＦＰ￣Ｒ ＴＣＧＣＣＣＴＴＧＣＴＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＣＴＡＧＡＡＴＡＡＴＡＧＣＴＧＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＡＧ
实时荧光定量 ＰＣＲ ＰｖｏＲＲ２２￣Ｆ ＡＴＴＴＣＡＧＴＧＴＧＣＴＴＧＴＧＧＴＧＧ
ＲＴ￣ｑＰＣＲ
ＰｖｏＲＲ２２￣Ｒ ＧＣＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＣ
ＰｖｏＧＡＰＤＨ￣Ｆ ＴＧＧＣＡＡＧＣＡＴＡＴＴＣＡＧＧＣＡＧＧＡＧ
ＰｖｏＧＡＰＤＨ￣Ｒ ＴＴＧＧＣＴＣＡＴＣＡＧＧＡＴＴＧＴＡＧＧＴＡＴＣＡＧ

２ 结果与分析

２.１ ＰｖｏＲＲ２２ 的基因克隆
以 拟 南 芥 ＡＲＲ２２ 的 蛋 白 序 列 ( ｈｔｔｐｓ: / /
ｗｗｗ.ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ.ｏｒｇ / ) 为参照ꎬ通过对星油藤本地
基因组 数 据 库 比 对 分 析ꎬ 筛 选 获 得 ｘｉｎｇｙｏｕｔｅｎｇ ＿
１００１４３１２ 的 序 列 信 息ꎬ 并 命 名 ＰｖｏＲＲ２２ꎮ 利 用
ＰｖｏＲＲ２２ ＣＤＳ 特异引物ꎬ经 ＰＣＲ 扩增后ꎬ获得 １ 条
５００ ｂｐ 左右的特异条带( 图 １)ꎬ与数据库中 ５１３
ｂｐ ＰｖｏＲＲ２２ ＣＤＳ 长度一致ꎻ对扩增产物进行胶回
收ꎬ利用同源重组法连接至 ｐＯＣＡ３０￣ＧＦＰ 载体ꎬ阳

性克隆测序结果表明ꎬ获得的序列与原序列一致ꎮ
２.２ ＰｖｏＲＲ２２ 的生物信息学分析
ＰｖｏＲＲ２２ 的 ＣＤＳ 为 ５１３ ｂｐꎬ编码 １７０ 个氨基

酸ꎬ蛋白分子量为 １８.６５ ｋＤａꎬ理论等电点为 ４.５４ꎬ
含有 ２６ 个带负电氨基酸ꎬ１３ 个带正电氨基酸ꎬ不

稳定系数为 ３９.４６ꎬ蛋白结构相对稳定ꎮ ＰｖｏＲＲ２２ Ｍ. Ｍａｒｋｅｒ ５０００ꎻ １. ＰＣＲ 扩增产物ꎮ
蛋白序列中第 ９３ 位半胱氨酸( Ｃｙｓ) 处具有亲水性 Ｍ. Ｍａｒｋｅｒ ５０００ꎻ １. ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ.

最大值ꎬ为 １.８９ꎬ第 １１ 位天冬氨酸( Ａｓｐ) 和第 １４ 图 １ ＰｖｏＲＲ２２ 基因编码序列 ＰＣＲ 扩增产物
位赖氨酸(Ｌｙｓ)处具有亲水性最小值ꎬ为－２.８０ꎬ亲 Ｆｉｇ. １ ＰＣＲ￣ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ ＰｖｏＲＲ２２ ｇｅｎｅ ＣＤＳ
水性平均值为 － ０. ２４ꎬ为亲水性蛋白( 图 ２: Ａ)ꎮ
跨膜结构域分析结果表明该蛋白无跨膜结构域ꎬ 分析 ＰｖｏＲＲ２２ 的蛋白序列的保守结构域ꎬ结果显
不属于跨膜蛋白(图 ２: Ｂ)ꎮ 蛋白质二级结构预测 示该 蛋 白 含 有 ＲＥＣ 结 构 域 ( 图 ２: Ｄ )ꎬ 表 明
结果显示 ＰｖｏＲＲ２２ 蛋白是由 ４４.７１％ 的 α￣螺旋、 ＰｖｏＲＲ２２ 属于 ＲＲｓ 基因家族ꎮ
４４.２１％的无规则卷曲和 １１.１８％的 β￣折叠构成(图 从 ＮＣＢＩ 数据库中下载拟南芥、葡萄和蓖麻等
２: Ｃ)ꎮ 利用 ＮＣＢＩ 的 Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｄｏｍａｉｎ Ｄａｔａｂａｓｅ １６ 种植物的 ＲＲ２２ 蛋白序列ꎬ并利用 ＭＥＧＡ ７.０ 软