Page 120 - 《广西植物》2025年第8期

１ ４ ８ ６ 广 西 植 物 ４５ 卷
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ 甄 艳 等ꎬ ２０１３ )ꎮ 针 叶 树 种 杉 木 种子用无菌手术刀和镊子剥除种子的内外种皮ꎬ
(Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａ ｌａｎｃｅｏｌａｔａ)的体胚在发育过程中ꎬ内 并将其接种至胚性愈伤组织诱导培养基( ＭＬＰ ＋
源激素脱落酸(ａｂｓｃｉｓｉｃ ａｃｉｄꎬＡＢＡ)与细胞系胚性密 １.０ ｍｇ Ｌ ６￣ＢＡ＋ １. ０ ｍｇ Ｌ ＫＴ ＋ １. ０ ｍｇ Ｌ ￣１
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切相关ꎬ内源 ＡＢＡ 含量随胚性的发育而增加ꎬ随胚 ＮＡＡ＋０.０４８ ｍｇＬ ＢＲ ＋ ５.０ ｍｇＬ ＡＢＡ ＋ ４５０
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成熟而下降(Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 在湿地松体胚发 ｍｇＬ Ｌ￣谷氨酰胺＋５００ ｍｇＬ 肌醇＋５００ ｍｇ
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生研究中仅见不同胚性细胞系之间激素含量差异ꎬ Ｌ 水解酪蛋白＋３０ ｇＬ 蔗糖＋４.０ ｇＬ 结冷胶)
高浓度的 ＡＢＡ 有利于胚性愈伤组织的形成和成熟 中ꎬ每皿 １０ 粒ꎬ每个家系接种 ３０ 皿ꎬ培养温度为
体胚的产生(程子珊等ꎬ２０２１)ꎬ而关于湿地松不同 (２３±１)℃ ꎬ暗培养ꎮ ２ 周左右胚性愈伤组织开始
胚性细胞系之间内源激素与理化指标差异尚未看到 出现ꎬ当其胚性愈伤组织团( 细胞系) 为豌豆粒大
系统研究ꎬ与成胚能力的研究也尚未查到相关文献ꎮ 小时进行继代增殖ꎬ将其接种至同一增殖培养基
本研究以湿地松 ７ 种不同细胞系的胚性愈伤 (ＭＬＰ＋０.２５ ｍｇＬ ６￣ＢＡ＋０.２５ ｍｇＬ ＫＴ＋４.００
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组织为材料ꎬ采用不同细胞系的体胚诱导率评价 ｍｇＬ ＮＡＡ＋４５０ ｍｇＬ Ｌ￣谷氨酰胺＋５００ ｍｇＬ ￣１
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体胚发生潜力ꎬ分析理化与激素等各项指标与体 肌醇＋５００ ｍｇＬ 水解酪蛋白＋３０ ｇＬ 麦芽糖＋
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胚数量的相关性ꎬ通过对比不同细胞系在形态特 ４.０ ｇＬ ￣１ 结冷胶) 中进行继代增殖ꎬ培养温度为
征、胚柄细胞团结构与数量、生理生化特性和内源 (２３±１)℃ꎬ暗培养ꎬ每 ２ 周继代 １ 次ꎮ
激素含量等方面的差异ꎬ探究影响细胞系胚性强 １.２.２ 细胞系形态学及细胞学观测 当湿地松每
弱的特征指标值ꎬ早期判别胚性较强的胚性细胞 个细胞系的愈伤组织含量继代至 ３０ ~ ４０ 皿时ꎬ采
系ꎬ为优化湿地松体胚发生和提高体胚诱导率等 用肉眼和体视显微镜下观测湿地松 ７ 个细胞系的
方面的研究提供技术参考ꎮ 本研究拟探讨:(１) 湿 形态特征ꎮ 利用醋酸洋红－伊文思蓝的双染色法
地松不同胚性细胞系愈伤组织表型特征、理化指 观测 细 胞 胚 性 及 其 胚 性 胚 柄 细 胞 团 ( ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ
标及其激素指标的差异ꎻ(２) 影响湿地松细胞系胚 ｓｕｓｐｅｎｓｏｒ ｍａｓｓꎬＥＳＭ) 聚集情况ꎬ先对不同细胞系
性强弱的特征指标值ꎮ 进行染色ꎬ每个细胞系取相同质量的愈伤组织置
于载玻片上ꎬ并用醋酸洋红染色 １５ ｍｉｎꎬ再用质量
１ 材料与方法 分数为 ０.０１％ 的伊文思蓝染色 ３ ｍｉｎꎬ压片ꎬ在体
视显微镜( 德国奥林帕斯ꎬＧＲＧＨＴ￣ＢＤＥＬ) 下观测
１.１ 材料 不同细胞系的 ＥＳＭ 结构与数量ꎮ
湿地松未成熟球果采自浙江省余杭长乐林场 １.２.３ 激素及生理生化指标测定方法 对每个细
湿地松高产脂种子园和江西省峡江县林木良种场 胞系称取 １ ｇ 胚性愈伤组织ꎬ３ 次重复ꎬ液氮速冻ꎬ
１.５ 代湿地松种子园ꎮ 参试细胞系共有 ７ 个ꎬ其中 超低温冰箱保存备用ꎮ 内源激素的测定采用酶联
Ｖ３０、Ｖ３４２ 和 Ｓ４０１ 细胞系是由浙江省余杭长乐林场 免 疫 法 ( ｅｎｚｙｍｅ￣ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏ ｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙꎬ
湿地松高产脂种子园提供的不同家系未成熟种子 ＥＬＩＳＡ) ( Ｙａｎｇ ＪＣ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１ꎻ Ｙａｎｇ ＹＭ ｅｔ ａｌ.ꎬ
诱导获得的细胞系ꎬＳ２.１、Ｓ１６ 和 Ｓ７( 包括 Ｓ７￣２ 和 ２００１ꎻＺｈａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６ )ꎻ 可 溶 性 蛋 白 ( ｓｏｌｕｂｌｅ
Ｓ７￣５ 细胞系ꎬ为同一家系不同未成熟种子诱导获 ｐｒｏｔｅｉｎꎬＳＰ)的测 定 采 用 考 马 斯 亮 蓝 法 ( 王 学 奎ꎬ
得ꎬ为不同基因型)细胞系是由江西省峡江县林木良 １９００)ꎻ可溶性糖( ｓｏｌｕｂｌｅ ｓｕｇａｒꎬＳＳ)、淀粉( ｓｔａｒｃｈ)

种场提供的不同家系未成熟种子诱导获得的细胞系ꎮ 的测定采用蒽酮比色法(王学奎ꎬ１９００)ꎻ超氧化物
１.２ 方法 歧化酶(ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬＳＯＤ) 的测定采用氮
１.２.１ 胚性细胞系的诱导与增殖 于 ２０２２ 年 ７ 月 蓝四唑光化还原法( 王学奎ꎬ１９００)ꎻ过氧化物酶

中下旬采集湿地松不同家系的健康未成熟球果ꎬ (ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＰＯＤ)的测定采用愈创木酚显色法( 王
取出未成熟种子ꎮ 首先ꎬ用自来水冲洗 ３０ ｍｉｎꎻ然 学奎ꎬ１９００)ꎻ过氧化氢酶(ｃａｔａｌａｓｅꎬＣＡＴ) 的测定采
后ꎬ转至操作台中用体积分数为 ７５％的酒精消毒 用紫外线吸收法(王学奎ꎬ１９００)ꎮ
３０ ｓꎬ无菌水清洗 ３ 遍ꎬ并用质量分数为 ０.１％的汞 １.２.４ 胚性愈伤组织的成熟培养 从湿地松 ７ 个细
消毒 １０ ｍｉｎꎬ无菌水清洗 ５ 遍ꎻ最后ꎬ用无菌滤纸 胞系中选取 ５ 个细胞系( Ｖ３０、Ｖ３４２、Ｓ２.１、Ｓ１６、Ｓ７￣
将种子表面多余的水分吸干ꎬ备用ꎮ 将消毒后的 ５)进行成熟培养ꎬ先取 １ ｇ 胚性愈伤组织在液体培