Page 154 - 《广西植物》2025年第8期

１ ５ ２ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
组小、较强的繁殖力、生长周期短( 一般情况下需 表 １ ＰＣＲ 扩增引物
８ ~ １０ 周)、基因多态型、遗传转化效率高、简单易 Ｔａｂｌｅ １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｉｍｅｒｓ
得和生长环境条件简单等(Ｖａｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００８ꎻＶｏｇｅｌ ＆ 退火温度
Ｈｉｌｌꎬ２００８ꎻＨｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００９)ꎮ 目前ꎬ关于 ＦＫＦ１ 基 基因 引物序列 (５′－３′) Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
因的研究对象大多数为拟南芥、水稻、玉米ꎬ而对 (℃ )
于二穗短柄草 ＢｄＦＫＦ１ 基因研究极为罕见ꎬ仅有李 ＢｄＦＫＦ１ Ｆ:ＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡ ５８

安等(２０２１) 通过二穗短柄草 ＢｄＦＫＦ１ 基因表达、 Ｒ:ＧＡＧＡＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＧＣＡＡＴＡ
亚细胞定位及蛋白互作分析发现 ＢｄＦＫＦ１ 蛋白存
在于细胞核上且与 ＢｄＣＤＦ１ 和 ＢｄＧＩ 蛋白均有互作
１.４ 转录组测序
关系ꎬ路雪萍等(２０２２) 在对二穗短柄草 ＢｄＣＯ 基
根据试剂盒 Ａｘｙｐｒｅｐ 的说明书提取总 ＲＮＡꎬ采
因表达与生物学功能分析中发现 ＢｄＦＫＦ１ 蛋白与
用 １％琼脂糖凝胶电泳对 ＲＮＡ 的质量和完整性进
ＢｄＣＯ 蛋白在细胞内有蛋白互作关系ꎮ 因此ꎬ本研
行评估ꎮ 委托苏州帕诺米克生物医药科技有限公
究以基因表达调控为研究区域ꎬ依托高通量测序
司进行参考基因组转录组测序ꎬ采用第二代测序
和生 物 信 息 学 分 析 方 法ꎬ 通 过 将 二 穗 短 柄 草
技 术 ( ｎｅｘｔ￣ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ＮＧＳ )ꎬ 基 于
ＢｄＦＫＦ１ 基 因 转 入 野 生 烟 草 中ꎬ 以 野 生 型 烟 草
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ 测 序 平 台ꎬ 对 文 库 进 行 双 末 端
(ＳＲ１) 和转基因烟草( ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ) 为材料ꎬ采用
转录组测序的方法ꎬ拟探讨以下问题:(１) ２ 种烟 ( ｐａｉｒｅｄ￣ｅｎｄꎬ ＰＥ) 测 序ꎬ 其 中 对 下 机 数 据 ( Ｒａｗ
Ｄａｔａ)进行统计分析ꎬ使用 Ｃｕｔａｄａｐｔ 软件去除平均
草在生殖生长期ꎬ差异表达基因主要富集在哪些
质量分数低于 Ｑ２０ 的 Ｒｅａｄｓꎬ使用 ＨＩＳＡＴ２ 软件将
通路ꎻ(２)与光周期相关的差异表达基因有哪些ꎻ
过滤后的 Ｒｅａｄｓ 比对到烟草的参考基因组上( Ｇｕｏ
(３)这些基因主要富集在哪些通路中ꎻ(４) ２ 种烟
草的开花时间ꎮ 本研究旨在为二穗短柄草分子植 ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２)ꎮ
１.５ 差异表达基因筛选
物育种提供理论依据ꎮ
使用 ＨＴＳｅｑ 统计比对到每一个基因上的 Ｒｅａｄ
１ 材料与方法 ｃｏｕｎｔ 值ꎬ作为基因的原始表达量( Ａｎｄｅｒｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２０１５)ꎬ采用 ＦＰＫＭ 对表达量进行标准化ꎬ以表达

１.１ 试验材料 差异 倍 数 ｜ ｌｏｇ ( Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ) ｜ > １ 和 显 著 性 Ｐ
２
ｖａｌｕｅ < ０.０５ 为筛选条件ꎬ筛选出具有差异表达的
野生 型 烟 草 ( ＳＲ１) 和 转 ＢｄＦＫＦ１ 基 因 烟 草
(ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ)由贵州 省 农 业 科 学 院 草 业 研 究 所 基因ꎮ
１.６ 差异表达基因火山图、聚类热图、ＧＯ 富集和
保存ꎮ
１.２ 试验处理 ＫＥＧＧ 富集分析
筛选大小相近的 ＳＲ１ 和 ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ 种子播 采用 Ｒ 语言 ｇｇｐｌｏｔｓ２ 软件和 Ｐｈｅａｔｍａｐ 软件包
种于高 ２５ ｃｍ、直径 ３０ ｃｍ 的花盆中ꎬ并置于人工 将筛选出的差异表达基因分别绘制成火山图和聚
气候室内进行长日照( ｌｏｎｇ￣ｄａｙꎬＬＤ) 处理(１６ ｈ 光 类热 图ꎬ 对 符 合 条 件 的 差 异 表 达 基 因 进 行 ＧＯ
(Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙꎬｈｔｔｐ: / / ｇｅｎｅｏｎｔｏｌｏｇｙ.ｏｒｇ / ) 和 ＫＥＧＧ
照 / ８ ｈ 黑暗)ꎬ定期浇水ꎬ昼夜温度控制在 ２３ ~ ２５
℃ ꎬ湿度为 ５５％ ~ ６０％ꎮ 于 ２０２２ 年 ７ 月 ２０ 日取其 (Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓꎬｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｋｅｇｇ.ｊｐ / ) 分类ꎬ通过超几何分布方法计算 Ｐ
幼嫩叶片进行液氮速冻保存以备后期试验使用ꎬ
每份材料取 ３ 个生物学重复ꎬ３ 片叶混样ꎬ观测记 ｖａｌｕｅ(显著富集的标准为 Ｐ ｖａｌｕｅ<０.０５) 并将得到
录植株第一次开花时间ꎬ其中野生型和转基因植 的不同 ＧＯ 和 ＫＥＧＧ 条目进行富集分析ꎮ
１.７ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析
株各有 １３ 株ꎮ
１.３ 转基因植株阳性鉴定 从转录组测序结果中随机挑选 ６ 个差异表达
根据 ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＮＡｓｅｃｕｒｅ 新 型 植 物 基 因 组 基因进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 验证ꎬ使用 ＧｏＳｃｒｉｐｔＴＭ 反转录
ＤＮＡ 提 取 试 剂 盒 说 明 书 提 取 ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ 叶 片 试剂盒将 ＲＮＡ 反转录为 ｃＤＮＡꎬ最后以反转录的
®
ＤＮＡꎬ其中 ＰＣＲ 扩增所需引物如表 １ 所示ꎮ ｃＤＮＡ 为 模 板 根 据 ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ