Page 155 - 《广西植物》2025年第8期
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８ 期 杨龙姣等: 二穗短柄草 ＢｄＦＫＦ１ 基因调控烟草开花的转录组学分析 １ ５ ２ １
(Ｐｒｏｍｅｇａꎬ北京) 试剂盒说明书进行 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 实 ２.２ 转录组原始数据整理、过滤、质量评估及比对分析
验ꎬ每个样品设计 ３ 个重复试验ꎮ 其中ꎬ以烟草 经测序质量控制ꎬ结果如表 ３ 所示ꎬ６ 个样品
－ΔΔＣｔ 法计算其
ＮｔＡｃｔｉｎ 基因作为内参基因ꎬ结果以 ２ 原始数据的 Ｒｅａｄｓ 数为 ３８ ６４６ ０８６ ~ ４５ ８４０ ２８４ꎬ
相对表达量ꎬ用于 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析的引物见表 ２ꎮ 高 质 量 序 列 Ｒｅａｄｓ 数 ( Ｃｌｅａｎ ＿ Ｒｅａｄｓ ) 为
３６ ３３９ ６６８ ~ ４３ １１１ ２３８ꎬ将过滤后的 Ｒｅａｄｓ 比对
表 ２ 烟草 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 引物 到参考基因组上ꎬ实验所产生的测序序列的总比
Ｔａｂｌｅ ２ Ｔｏｂａｃｃｏ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ 对率和唯一比对率高于 ９５％ꎬ则参考基因组选择
退火温度 合适且相关实验不存在污染ꎮ 样本中的碱基识别
基因 引物序列 (５′－３′) Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
正确率(Ｑ３０ꎬ表示碱基识别错误的概率为 ０.１％)
Ｇｅｎｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
(℃ ) 所占比例均超过 ９０％ꎬ以上结果表明测序数据质
ＧＩ１ Ｆ:ＴＣＡＡＣＣＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＡＧＣＡ ５５ 量可靠ꎬ可用于后续分析ꎮ
２.３ 差异表达基因分析
Ｒ:ＴＣＣＡＴＧＧＴＴＧＣＡＡＴＴＣＣＣＴＣＴ
２.３.１ 差异表达基因的筛选 本试验采用 ＲＮＡ￣ｓｅｑ
ＰＲＲ３７ Ｆ:ＴＣＡＣＴＣＧＧＣＴＣＡＡＡＧＡＡＣＧＧ
技术ꎬ对 ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ 植株材料(受体材料为 ＳＲ１)和
Ｒ:ＴＣＴＧＣＡＴＣＣＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＡ
ＳＲ１ 植株材料进行了转录组测序ꎬ对基因表达进行
ＦＴ２ ｌｉｋｅ Ｆ:ＧＧＡＧＴＡＴＣＴＧＣＡＣＴＧＧＣＴＧＧ
差异分析ꎬ结果如图 ３ 所示ꎬ在 ＳＲ１ ｖｓ ＦＫＦ１ 组中检
Ｒ:ＡＣＡＡＣＣＴＣＴＣＧＡＴＣＣＡＡＴＴＧＣＴ
测到 ４７２ 个基因差异表达ꎬ其中上调基因为 ２４８ 个ꎬ
ＦＴ３ Ｆ:ＣＧＡＣＡＡＴＴＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＧＴＴＧＴＧ
下调基因为 ２２４ 个ꎬ表明二穗短柄草 ＢｄＦＫＦ１ 基因
Ｒ:ＧＣＣＡＣＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＴＴＣＣＣ
的插入会影响烟草中相关基因的表达ꎮ
ｒｏｏｔ ｐｈｏｔｏｔｒｏｐｉｓｍ Ｆ:ＧＴＣＧＡＴＡＴＣＴＡＴＴＴＧＡＡＧＧＣＧＣＡ ２.３.２ 差异表达基因 ＧＯ 功能富集分析 对差异表
ｐｒｏｔｅｉｎ ２
达基因按照生物过程(ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓꎬＢＰ)、细胞
Ｒ:ＴＧＡＡＧＧＡＣＴＡＴＴＴＧＣＡＣＴＧＧＣＡ
ＲＩＣＥＳＬＥＥＰＥＲ Ｆ:ＧＧＡＣＡＧＴＧＡＣＧＡＡＡＴＧＴＧＧＣ 组分(ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔꎬＣＣ)、分子功能(ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
２￣ｌｉｋｅ
ｆｕｎｃｔｉｏｎꎬＭＦ)进行 ＧＯ 分类ꎬ在每个 ＧＯ 分类中挑
Ｒ:ＴＧＡＡＡＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＣＣＡＡ
ＮｔＡｃｔｉｎ Ｆ:ＡＡＣＡＧＴＴＴＧＧＴＴＧＧＡＧＴＴＣＴＧＧ 选 Ｐ ｖａｌｕｅ 值 最 小 即 富 集 最 显 著 的 前 １０ 个 ＧＯ
Ｒ:ＣＡＴＧＡＡＧＡＴＴＡＡＡＧＧＣＧＧＡＧＴＧ ｔｅｒｍ 条目进行展示ꎬ结果如图 ４ 所示ꎬ在 ＳＲ１ ｖｓ
ＦＫＦ１ 组 中ꎬ在生物过程中显著富集在 Ｕ５ 小核核
糖核蛋白体、细胞壁和外部封装结构通路中ꎬ在分
１.８ 数据处理 子功能中显著富集于氧化还原酶活性中ꎬ作用于
对试验所得的数据用 ＳＰＳＳ ２６ 进行单因素分 成对供体、单加氧酶活性和铁离子结合通路中ꎬ在
析ꎬ运用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９.０.０ 软件作图ꎮ 生物过程中显著富集于蓝光反应、黄酮类生物合
成过程和向光性通路中ꎮ
２ 结果与分析 ２.３.３ 差异表达基因 ＫＥＧＧ 通路富集分析 根据
差异表达基因的 Ｐ ｖａｌｕｅ 值最小的前 ３０ 条通路进
２.１ 转 ＢｄＦＫＦ１ 基因烟草植株的构建 行 ＫＥＧＧ 通路富集ꎬ结果如图 ５ 所 示ꎬ在 ＳＲ１ ｖｓ
对 ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ 烟草进行 ＰＣＲ 阳性鉴定实验ꎬ ＦＫＦ１ 组中ꎬ显著富集到环境信息处理过程中的 ２
所用引物是 ＢｄＦＫＦ１ 特异性引物ꎬ产物长度为 ４１３ 条通路ꎬ包括 ＡＢＣ 转运蛋白和植物激素信号转导ꎻ
ｂｐꎬ结果如图 １ 所示ꎬ条带在 ２５０ ~ ５００ ｂｐ 之间ꎬ与 显著富集到遗传信息处理过程中的内质网中蛋白
产物长度相符ꎬＢｄＦＫＦ１ 转 ＳＲ１ 得到 １３ 株阳性植 质加工 １ 条通路ꎻ显著富集到新陈代谢通路中的
株(其中 ４ － １６ 为阳性苗ꎬ其他均为阴性苗)ꎮ 提 ２５ 条ꎬ其中富集最显著的有角质、木栓素和蜡的生
取转 ＢｄＦＫＦ１ 基因烟草 ＲＮＡꎬ经反转录后通过 ＲＴ￣ 物合成ꎬ黄酮类生物合成ꎬ倍半萜和三萜生物合成
ｑＰＣＲ 检测 ＢｄＦＫＦ１ 的表达 情 况ꎬ结 果 如 图 ２ 所 及泛醌和其他萜类－醌生物合成ꎻ显著富集到生物
示ꎬ在 ＢｄＦＫＦ１￣ＯＥ 中ꎬＢｄＦＫＦ１ 表达量远远大于 １ꎬ 体系统中的昼夜节律－植物和植物与病原体相互
证明 ＢｄＦＫＦ１ 转基因烟草植株构建成功ꎮ 作用 ２ 条通路ꎮ
