Page 59 - 《广西植物》2026年第1期

１ 期 王雅珂等: 天贵卷瓣兰内生真菌分离鉴定及其促生作用研究 ５ ５

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等ꎮ 采用直接挑取制片法ꎬ于德国徕卡 ＤＭ ２５００ １５０ ｒｍｉｎ 条件下振荡培养 ５ ｄꎬ每株内生真菌设
显微镜下进行真菌形态观察ꎬ记录菌丝的特征及 置 ３ 个重复ꎮ ５ ｄ 后吸取 ５ ~ １０ ｍＬ 菌液置于离心
结构ꎬ分生孢子的形态、大小等特征ꎮ 管中ꎬ将 离 心 管 放 入 离 心 机ꎬ 室 温 下 １２ ０００ ｒ
１.２.４ 内生真菌分子鉴定 将纯化后的菌株接种 ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎮ 取 １ ｍＬ 上清液和 ２ 倍体积的
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至 ＰＤＡ 培养基上培养 １０ ｄ 左右ꎬ利用北京酷来搏 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ 比色液(１.０１５ ｇ 六水氯化铁、１５０ ｍＬ 浓
科技有限公司 ＣＴＡＢ 试剂盒提取内生真菌 ＤＮＡ 用 硫酸、２５０ ｍＬ 蒸馏水)ꎬ混匀ꎮ 阴性对照为 １ ｍＬ 未
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于 ＰＣＲ 扩 增ꎬ 扩 增 引 物 如 下: ＩＴＳ１ ( ５′￣ 接菌的 ＰＤＢ 培养基ꎬ阳性对照为 １ ｍＬ ５０ ｍｇＬ
ＴＣＣＧＴＡＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＣＧＧ￣３′) 和 ＩＴＳ４ ( ５′￣ 的 ＩＡＡ 溶液ꎮ 在黑暗环境下静置 ３０ ｍｉｎ 后观察颜
ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′)ꎮ 采用 ５０ μＬ ＰＣＲ 色变化ꎬ若颜色变成粉红色或红色ꎬ则说明菌株具
扩增体系:２５ μＬ ２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘꎬ上下游引 有产 ＩＡＡ 的能力ꎮ
物各 ２ μＬꎬＤＮＡ 模板 ２ μＬꎬ２１ μＬ ｄｄＨ Ｏꎮ 反应程 １.２.７ 内生真菌促生作用验证 为进一步验证天
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序如下:９４ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃ 贵卷瓣兰内生真菌的促生作用ꎬ选择从天贵卷瓣
退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ循环 ３０ 次ꎬ７２ ℃ 终延 兰根部分离出的内生真菌以及从 １.２.５ 和 １.２.６ 中
伸 ５ ｍｉｎꎬ最后 １６ ℃ 保温ꎮ 反应结束后取 ５ μＬ 反 筛选出的具有促生特性的部分内生真菌ꎬ利用培
应产物进行琼脂糖凝胶电泳检验ꎬ得到的 ＰＣＲ 产 养基打孔的方式将打下的长有真菌的培养基圆柱
物送至武汉擎科创新生物有限科技公司进行纯化 投入 １５０ ｍＬ ＰＤＢ 液体培养基ꎬ每瓶液体培养基投
和测序ꎬ将测序所得菌株的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列在美国 入 ５ 个培养基圆柱ꎬ２８ ℃ 、１２０ ｒｍｉｎ 振荡培养 ７
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国家生 物 技 术 信 息 中 心 ( ＮＣＢＩ 数 据 库 ｈｔｔｐｓ: / / ｄ 获得发酵液ꎬ利用移液枪吸取 １０ ｍＬ 真菌发酵
ｂｌａｓｔ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ.Ｃｇｉ) 中进行 ＢＬＡＳＴ 同 液ꎬ缓慢滴于天贵卷瓣兰幼苗的叶片、茎基部以及
源性 比 对 分 析ꎬ 挑 选 并 下 载 吻 合 度 较 高 ( 大 于 周围基质ꎬ试验设 ６ 个处理组和 １ 个对照组ꎬ每个
９７％)的序列用于初步分子鉴定ꎮ 将供试菌株与 处理 １０ 株ꎬ３ 个重复ꎬ共 ３０ 株ꎻ对照组喷施 ＰＤＢ
所下载其他菌株序列置于 ＭＥＧＡ １２.０ 软件中构建 培养基ꎮ 每隔 １０ ｄ 用相同方式处理 １ 次ꎬ共处理 ３
系统发育树ꎮ 次ꎮ 观察不同真菌发酵液对幼苗的整体促生效
１.２.５ 内 生 真 菌 溶 磷 能 力 测 定 参 考 毛 欣 颖 等 应ꎬ实验所用幼苗为经过移栽驯化 ６ 个月且长势
(２０２５)的方法ꎬ通过溶磷圈法测定菌株的溶磷能 基本一致的组培苗ꎻ移栽基质经过高压灭菌ꎬ配比
力ꎬ挑取活化后的内生真菌菌块接种于有机磷( 培 为蛭石 ∶ 珍珠岩 ＝ ２ ∶ １( 体积比)ꎮ 实验期间定期
养基成分如下:葡萄糖 １０ ｇ、硫酸铵 ０.５ ｇ、酵母浸 喷施无菌水保持基质水分ꎬ并进行隔离培养ꎮ ９０ ｄ
粉 ０.５ ｇ、氯化钠 ０.３ ｇ、氯化钾 ０.３ ｇ、硫酸镁 ０.３ ｇ、 后随机选取 ５ 株天贵卷瓣兰幼苗ꎬ并对其株高、根
硫酸亚铁 ０.０３ ｇ、硫酸锰 ０.０３ ｇ、卵磷脂 ０.２ ｇ、碳酸 长、根数进行统计ꎬ同时记录生长大小一致(２ ~ ３.５
钙 １.０ ｇ、琼脂 １５ ｇ、蒸馏水定容至１ ０００ ｍＬꎬｐＨ ７ ~ ｃｍ)叶片鲜重ꎬ计算平均值及方差ꎮ
７.５)与无机磷( 培养基成分如下:葡萄糖 １０ ｇ、硫 １.３ 数据统计
酸铵 ０.５ ｇ、酵母浸粉 ０.５ ｇ、氯化钠 ０.３ ｇ、氯化钾 试验数据采用 ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２６.０ 和 ＷＰＳ 软

０.３ ｇ、硫酸镁 ０.３ ｇ、硫酸亚铁 ０.０３ ｇ、硫酸锰 ０.０３ 件进行处理ꎮ
ｇ、卵磷脂 ０.２ ｇ、碳酸钙 １.０ ｇ、琼脂 １５ ｇ、蒸馏水定
容至１ ０００ ｍＬꎬｐＨ ７ ~ ７.５) 培养基平板中ꎬ２８ ℃ 恒 ２ 结果与分析

温倒置培养ꎬ每株内生真菌设置 ３ 个重复ꎬ３ ~ ５ ｄ
内观察透明溶磷圈的出现并选出具有溶磷活性的 ２.１ 不同器官最佳消毒时间的确定
菌株ꎬ在第 ５ 天测定透明圈直径( Ｄ) 和菌落直径 采用 １.２.１ 所述方法对天贵卷瓣兰植物组织
(ｄ)ꎬ计 算 内 生 真 菌 的 溶 磷 指 数ꎮ 其 中ꎬ 溶 磷 指 表面进行消毒ꎬ结果发现当消毒时间达到 ３ ｍｉｎ

数 ＝ Ｄ / ｄꎬ比值越大ꎬ溶磷能力越强ꎮ 时ꎬ根部消毒彻底ꎬ假鳞茎、横走茎、叶片等部位有
１.２.６ 内生真菌产 ＩＡＡ 能力测定 采用 Ｓａｌｋｏｗｓｋｉ 污染现象ꎻ当消毒 ５ ｍｉｎ 时ꎬ假鳞茎、横走茎、叶片
比色法(周士家等ꎬ２０２４) 将待测菌株分别接种于 等部位均消毒彻底ꎻ当消毒 ７ ｍｉｎ 时ꎬ根部平板并
￣１ 未出现菌落ꎬ而假鳞茎、横走茎、叶片等部位平板
含有 ２００ ｍｇＬ Ｌ￣色氨酸的 ＰＤＢ 培养基ꎬ２８ ℃ 、