Page 43 - 《广西植物》2026年第2期
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２ 期 牛靓洁等: 雪松花粉的淀粉粒在萌发过程中的变化 ２ ３ ７
粉ꎮ 选择散粉期的玉米植株( 郑单 ９５８)ꎬ收集成 采用二硝基水杨酸( ＤＮＳ) 比色法测定还原糖
熟花粉ꎬ置于室内自然干燥ꎮ 用滤网去除花粉中 含量ꎬ采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量ꎬ具体方
的杂质后ꎬ用于理化性质分析ꎻ其余的存放在－ ８０ 法参照说明书(ＢＣ０２３５ꎬＢＣ００３５ꎬ北京索莱宝科技
℃ 冰箱中保存备用ꎮ 有限公司)ꎮ
１.２ 方法 １.２. ５ 花 粉 淀 粉 酶 活 性 测 定 使 用 试 剂 盒
１.２.１ 花粉的培养与观察 使用 Ｉ ￣ＫＩ 溶液对成熟花 (ＢＣ２０４５ꎬ北京索莱宝科技有限公司) 测定花粉中
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粉染色ꎬ在光镜下观察ꎮ 雪松花粉萌发实验参考田 α￣淀粉酶和 β￣淀粉酶的活性ꎬ具体方法参照说明
菊等(２０１２)的方法并适当改动ꎮ 雪松花粉在 ２６ ℃ 书ꎬ计算总淀粉酶、α￣淀粉酶和 β￣淀粉酶的活性ꎮ
下培养ꎬ观察花粉的萌发情况ꎮ 当花粉管长度大于 １.２.６ 花粉中淀粉同工酶活性分析 参考赵会君
花粉粒直径时ꎬ认定花粉已萌发ꎮ 观察花粉总数不少 等(２００８)的方法ꎬ采用 １０％非变性聚丙烯酰胺凝
于 ３００ 粒ꎬ图片通过 ＴｏｕｐＶｉｅｗ ｘ８６ 软件进行处理ꎮ 胶电泳( Ｎａｔｉｖｅ￣ＰＡＧＥ) 分析淀粉酶同工酶ꎮ 花粉
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１.２.２ 电镜样品的制备与观察 花粉及淀粉粒的 (０.０１ ｇ) 在 １. ０ ｍＬ 缓冲液( ０. ３５ ｍｏｌＬ 蔗糖、
扫描电镜观察参照 Ｎｉｕ 等(２０１９) 的方法ꎮ 花粉或 ０.０５ ｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ)中冰浴研磨ꎬ离心(１２ ０００ ｇꎬ１０
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淀粉粒 依 次 在 不 同 浓 度 乙 醇 ( ３０％、５０％、７０％、 ｍｉｎꎬ４ ℃ )ꎬ上清液用于电泳分析ꎮ 测定 α￣淀粉酶
８０％、９０％和 １００％)中脱水 １０ ｍｉｎꎬ在叔丁醇中脱 同工酶活性时ꎬ样品在 ７０ ℃ 水浴中 １０ ｍｉｎ 以钝化
水 １５ ｍｉｎꎮ 脱水后的样品在室温下风干ꎬ在离子 β￣淀粉酶同工酶ꎮ 电泳结束后ꎬ蛋白胶在 １.５％的
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溅射仪( ＪＦＣ￣１６００ ＡＵＴＯ ＣＯＡＴＥＲꎬ ＪＥＯＬꎬ Ｊａｐａｎ) 可溶性淀粉溶液(０.２ ｍｏｌＬ 乙酸溶液配制) 中
中用金粒涂覆 ６ 次ꎬ每次 ３０ ｓꎮ 使用场发射扫描电 ３７ ℃ 孵育 ３ ｈꎬ之后用 ０.２ ｍｏｌＬ 乙酸溶液冲洗ꎬ
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镜(ＳＥＭ)(ＳＵ８０１０ꎬ Ｈｉｔａｃｈｉꎬ Ｔｏｋｙｏꎬ Ｊａｐａｎ)观察花 加入 Ｉ ￣ＫＩ 溶液染色 ２０ ｍｉｎꎬ拍照记录ꎮ
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粉或淀粉粒形态ꎮ 透射电镜的样品固定、脱水、包 １.２.７ 花 粉 中 淀 粉 酶 提 取 及 其 活 性 分 析 称 取
埋以及低温紫外聚合参照 Ｌｉ 等(２０２１) 的方法ꎬ在 ０.０１ ｇ 花粉ꎬ加入 ０.８ ｍＬ 蒸馏水ꎬ研磨后匀浆液转
入离心管中ꎬ在室温下摇晃提取 １５ ｍｉｎꎬ室温离心
透射电子显微镜 ＨＴ７７００( Ｈｉｔａｃｈｉꎬ Ｊａｐａｎ) 下观察ꎮ
使用 ＣａｓｅＶｉｅｗｅｒ ２.４ 软件处理图像ꎮ (６ ０００ ｇꎬ１０ ｍｉｎ)ꎻ收集上清液ꎬ加入蒸馏水定容
１.２.３ 淀粉粒的提取与纯化 淀粉粒的提取与纯 至 １０ ｍＬꎬ摇匀ꎬ即为淀粉酶提取液ꎬ测定其中的蛋
化参照 Ｎｉｕ 等(２０１９) 建立的两相法ꎮ 取 ０.１ ｇ 雪 白质含量ꎮ 配制 ０.１％ 玉米淀粉( Ｃａｔ:ＬＡ１０８０ꎬ北
松或玉米花粉ꎬ置于 ２ ｍＬ、５０ ｍｍｏｌＬ 磷酸盐缓 京索 莱 宝 科 技 有 限 公 司) 和 可 溶 性 淀 粉 ( Ｃａｔ:
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冲液(ｐＨ ６.８) 中研磨ꎮ 使用 １００ μｍ 和 ３０ μｍ 细 Ｇ８３００ꎬ北京索莱宝科技有限公司)溶液ꎬ加入等蛋
胞筛依次过滤花粉匀浆液ꎮ 滤液 ５ ０００ ｇ 离心 ３ 白量的雪松和玉米的淀粉酶提取液ꎬ根据还原糖
ｍｉｎꎬ沉淀即为粗淀粉样品ꎮ 依次向沉淀 中 加 入 的生成量比较 ２ 种花粉淀粉酶活性ꎮ
￣１ １.２.８ 淀粉结合蛋白的提取与分析 淀粉结合蛋白
６００ μＬ 的 ９０％ 乙醇和 １ ２００ μＬ 的 ２. ７ ｍｏｌＬ
ＮａＨ ＰＯ ꎬ混匀ꎬ５ ０００ ｇ 离心 ３ ｍｉｎꎻ淀粉沉淀在离 的提取方法详见 Ｎｉｕ 等(２０１９)ꎮ 淀粉样品于室温
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心管底部ꎬ用蒸馏水冲洗后晾干备用ꎮ 下在缓冲液(０.１ ｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬｐＨ ６.８ꎬ１％ ＳＤＳꎬ
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１.２.４ 花粉淀粉相关理化性质测定 使用 Ｍｅｇａｚｙｍｅ ２０ ｍｍｏｌＬ ＤＴＴꎬ１ ｍｍｏｌＬ ＰＭＳＦ) 中剧烈摇晃
试剂盒(Ｋ￣ＴＳＴＡ￣１００Ａꎬ Ｍｅｇａｚｙｍｅꎬ Ｉｒｅｌａｎｄ) 进行淀 ２０ ｍｉｎꎬ提取淀粉粒表面结合松散的蛋白质ꎮ 离心
粉含量测定ꎬ具体方法参照说明书ꎮ 参考 Ｂｏｏｎｋｏｒ (１２ ０００ ｇꎬ１０ ｍｉｎꎬ４ ℃)后ꎬ上清液使用苯酚法提取
等(２０２２)的方法测定糊化温度ꎮ 采用差示扫描量 蛋白质ꎮ 去除表面蛋白后ꎬ沉淀在 ＳＤＳ 缓冲液中煮
热 法 ( ＤＳＣꎬ ｍｏｄｅｌ ＤＳＣ １ꎬ Ｓｔａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍꎬ Ｍｅｔｔｌｅｒ￣ 沸 ２０ ｍｉｎꎬ提取淀粉粒内部紧密结合的蛋白质ꎮ 重
Ｔｏｌｅｄｏꎬ Ｇｒｅｉｆｅｎｓｅｅꎬ Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ) 测定淀粉的糊化热 复提取 ２ 次ꎮ 冷却后离心ꎬ上清液同苯酚抽提ꎮ 蛋
性能[Ｖ(淀粉) ∶ Ｖ(蒸馏水)＝ １ ∶ ２.５]ꎮ 采用标准 白质含量通过考马斯亮蓝染色法测定 ( Ｂｒａｄｆｏｒｄꎬ
碘比色法(王仪春等ꎬ２００１)测定直链淀粉含量ꎮ 淀 １９７６)ꎮ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 用 １２.５％的凝胶在 ３０ ｍＡ 恒流
粉在沸水浴中充分碱解ꎬ乙酸中和后ꎬ加入 Ｉ ￣ＫＩ 溶 下进行ꎮ 电泳后ꎬ凝胶使用考马斯亮蓝 Ｇ３５０ 染色ꎬ
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液显色ꎬ在 ６２０ ｎｍ 波长下测定吸光值ꎮ 根据标准曲 或通过半干法电泳转移系统( Ｔｒａｎｓ￣Ｂｌｏｔ ＳＤꎬ Ｂｉｏ￣
线计算直链淀粉浓度ꎮ Ｒａｄꎬ ＵＳＡ ) 将 蛋 白 质 转 移 到 ＰＶＤＦ 膜 ( ＧＥ
