Page 50 - 《广西植物》2026年第5期
P. 50
７ ８ ２ 广 西 植 物 ４６ 卷
胁迫响应的理论体系ꎬ并为基于该基因的抗逆育 用 １.２％琼脂糖凝胶电泳检测ꎮ 将扩增产物胶回
种提供理论依据和基因资源ꎮ 收ꎬ连接 ｐＥＧＯＥＰ３５Ｓ￣Ｈ￣ＧＦＰ￣ＧＵＳ 载体并测序ꎮ
本研究以高 Ｃｄ 积累油菜品种‘ 南油 ８６８’ 为 １.２.２ 生物信息学分析 将测序获得的 ＢｎａＭＹＢ４
材料ꎬ采用 ＲＴ￣ＰＣＲ 克隆、生物信息学分析、亚细胞 序列 进 行 ＢＬＡＳＴ 比 对ꎬ 搜 索 相 似 序 列ꎻ 用 ＮＣＢＩ
定位 及 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 表 达 分 析 等 方 法ꎬ 系 统 解 析 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｇｏｒｆ/
ＢｎａＭＹＢ４ 的序列特征、亚细胞定位及 Ｃｄ 胁迫下的 ｇｏｒｆ.ｈｔｍｌ)查找开放阅读框ꎻ用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ: / /
表达模式ꎬ旨在明确:(１) 甘蓝型油菜 ＢｎａＭＹＢ４ 是 ｗｗｗ. ｅｘｐａｓｙ. ｃｈ / ｔｏｏｌｓ/ ｐｒｏｔｐａｒａｍ. ｈｔｍｌ) 分 析 编 码 蛋
否编码典型 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 转录因子ꎻ(２)其是否定位 白的理化性质ꎻ用 ＣｌｕｓｔａｌＸ２ 进行多序列比对ꎻ用
于细胞核并响应 Ｃｄ 胁迫ꎻ(３) Ｃｄ 胁迫下该基因的 ＭＡＧＡ １１.０ 构建系统进化树ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 重复 １ ０００
组织表达特征ꎮ 本研究结果将为揭示甘蓝型油菜 次ꎻ 通 过 ＮＣＢＩＣＤＤ 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ.
Ｃｄ 胁迫响应的分子机制及其抗逆育种提供重要理 ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｃｄｄ / ｗｒｐｓｂ. ｃｇｉ) 预 测 蛋 白 功
论支撑与候选基因资源ꎮ 能结 构 域ꎻ 用 ＣＥＬＬＯ ｖ２. ５ ( ｈｔｔｐ: / / ｃｅｌｌｏ. ｌｉｆｅ. ｎｃｔｕ.
ｅｄｕ.ｔｗ / )和 ＷＯＬＦ ＰＳＯＲＴ 进行亚细胞定位预测ꎻ
１ 材料与方法 用 ＳｉｇｎａｌＰ 进 行 信 号 肽 预 测ꎻ 用 ＴＭＨＭＭ Ｓｅｒｖｅｒ
ｖ. ２. ０ 进行跨膜区分析ꎻ用 ＳＯＰＭＡ( ｈｔｔｐ: / / ｎｐｓａ￣
１.１ 材料 ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ /
供试甘蓝 型 油 菜 ‘ 南 油 ８６８’ ( ２ｎ ＝ ４ｘ ＝ ３８ꎬ ＮＰＳＡ / ｎｐｓａ＿ ｈｎｎ. ｈｔｍｌ) 预 测 蛋 白 二 级 结 构ꎻ 用
ＡＡＣＣ)具有高产、高油、早熟、抗倒伏等特征ꎬ种子 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
由凯里学院保存ꎮ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ / ４ｍ８ｂＰＸ / ｍｏｄｅｌｓ/ )预测三级结构ꎮ
１.２ 方法 １.２.３ ＢｎａＭＹＢ４ 启动子序列分析 从油菜基因组
１.２. １ ＢｎａＭＹＢ４ 转 录 因 子 的 克 隆 根 据 ＮＣＢＩ 数据库中获取 ＢｎａＭＹＢ４ 启动子区域(开放阅读框
(ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ) 中 公 布 的 ＭＹＢ４￣３. １ ( 上 游 ) ２ ０００ ｂｐꎬ 使 用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐ:/ /
ＫＲ０７６５５１ ) 序 列ꎬ采 用 Ｐｒｉｍｅｒ ５. ０ 设 计 引 物 Ｆ１￣ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ.ｐｓｂ.ｕｇｅｎｔ.ｂｅ/ ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ/ ｈｔｍｌ/ )
ＭＹＢ４(ＤＰｓｅｎ)(５′￣ＡｃｔａｇｇｇｔｃｔｃＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧ 分析顺式作用元件ꎮ
ＧＴＣＡＣＣＧＴＧＴＴＧＴ￣３′)、Ｆ２￣ＭＹＢ４ ( ＤＰａｎｔｉｓｅｎ) ( ５′￣ １.２.４ ＢｎａＭＹＢ４ 亚细胞定位 以绿色荧光蛋白作
ＡｃｔａｇｇｇｔｃｔｃＴＣＧＣＣ ＴＴＴＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＴＴＣＴＡＡＡＡＣ 为报告基因ꎬ构 建 融 合 表 达 载 体 ｐＥＧＯＥＰ３５Ｓ￣Ｈ￣
ＣＡＡＡ ＡＡＧＡＣ￣３′)ꎬ由生工生物工程( 上海) 股份 ＭＹＢ￣ＧＦＰ￣ＧＵＳꎬ将构建好的载体质粒通过电转化
有限公司合成ꎮ 以‘ 南油 ８６８’ 的 ｃＤＮＡ 为模板进 法转入农杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ３０ ℃ 培养 ２ ｄꎬ通过农杆菌
行 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩 增ꎮ 总 ＲＮＡ 提 取 自 五 叶 期 ‘ 南 油 介导法将过表达载体导入烟草叶片( 挑选生长一
８６８’幼苗叶片ꎬ具体方法如下:采集正常生长条件 个月ꎬ生长状况良好的烟草植株ꎬ用去针头的 １ ｍＬ
下新鲜叶片ꎬ经液氮速冻后于－８０ ℃ 保存ꎬ使用纳 注射器从叶片下表皮注射并标记)ꎮ 将注射后的
磁生物磁珠法植物 ＲＮＡ 提取试剂盒提取总 ＲＮＡꎬ 烟草植株弱光培养 ２ ｄꎬ取标记叶片制作玻片ꎬ在
并通 过 １％ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 其 完 整 性ꎬ 激光共聚焦显微镜下观察ꎮ ＧＦＰ 激发光波长 ４８８
ＮａｎｏＤｒｏｐ 测定纯度与浓度ꎮ 其 ｃＤＮＡ 合成方法如 ｎｍ、发射光波长 ５１０ ｎｍꎬ叶绿素激发光波长 ６４０
下:取 １ μｇ 总 ＲＮＡꎬ参照 Ｅｖｏ Ｍ￣ＭＬＶ ＲＴ Ｍｉｘ Ｋｉｔ ｎｍ、发射光波长 ６７５ ｎｍ(Ｗａｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４)ꎮ
ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ｆｏｒ ｑＰＣＲ Ｖｅｒ.２ 说明书进行反转 １.２.５ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析 选择饱满无病菌的‘ 南油
８６８’油菜种子ꎬ经表面消毒后播种于 １ / ２ ＭＳ 固体
录ꎬ获得 ｃＤＮＡꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ 反应体系如下:２ × ＰＣＲ
￣１ 培养基中ꎬ在 ２５ ℃ 、１６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑暗条件下培
ｂｕｆｆｅｒ ２５ μＬ、２ ｍｍｏｌＬ ｄＮＴＰｓ １０ μＬ、２０ μｍｏｌ
Ｌ 正反向引物各 １ μＬ、ＫＯＤ￣ＦＸ １ μＬ、ｃＤＮＡ 模板 养 ２０ ｄꎮ 选取生长一致的五叶期幼苗ꎬ移栽至含
￣１
(１００ ｎｇμＬ ) １ μＬꎬ加灭菌 ｄｄＨ Ｏ 至总体积为 珍珠岩与蛭石(１ ∶ １ꎬ Ｖ / Ｖ) 混合基质的 ９ ｃｍ 花盆
￣１
２
５０ μＬꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ 扩 增 程 序 如 下: ９８ ℃ 预 变 性 ３ 中ꎬ每盆 １ 株ꎮ 植株在温室中继续培养至生长稳
ｍｉｎꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓꎬ５８ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ６８ ℃ 延伸 １ 定后ꎬ进行 Ｃｄ 胁迫处理ꎮ 设置 ３ 个 Ｃｄ 浓度处理
￣１
ｍｉｎꎬ３２ 个循环ꎻ６８ ℃ 最终延伸 ２ ｍｉｎꎮ 反应产物 组:０(对照)、５、１０ ｍｇｋｇ Ｃｄ(以 ＣｄＣｌ ２.５Ｈ Ｏ
２
２
