Page 51 - 《广西植物》2026年第5期
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５ 期 王建伟等: 甘蓝型油菜转录因子 ＭＹＢ４ 的克隆、亚细胞定位及表达分析 ７ ８ ３
溶液形式)ꎬ每处理组设 ３ 个生物学重复ꎬ每重复 ５
株ꎮ 对照浇灌等量蒸馏水ꎮ 处理 １５ ｄ 后ꎬ观察植
株生长情况并取样ꎮ 取样时小心取出植株ꎬ用蒸
￣１
馏水洗净根部基质ꎬ随后用 １０ ｍｍｏｌ Ｌ Ｎａ ￣ＥＤＴＡ
２
溶液浸泡 ２０ ｍｉｎ 以去除根部表面吸附的 Ｃｄꎬ最后
用超纯水冲洗 ３ 次ꎮ 分别采集根、茎、叶组织ꎬ液
氮速冻后保存于－８０ ℃ 备用ꎮ
采用纳磁生物磁珠法植物 ＲＮＡ 提取试剂盒
( 货号 ＮＭＲ０３１１) 提取各组织总 ＲＮＡꎮ 参考 Ｅｖｏ
Ｍ￣ＭＬＶ ＲＴ Ｍｉｘ Ｋｉｔ ｗｉｔｈ ｇＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ｆｏｒ ｑＰＣＲ Ｖｅｒ.２
说明书进行反转录ꎬ以其产物为 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 模板ꎮ Ｍ. ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ １. 目的片段ꎮ
利用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳ 预混型 ｑＰＣＲ 试剂盒 Ｍ. ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ １. Ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔ.
ＩＩＩꎬ 以 油 菜 Ａｃｔｉｎ７ 基 因 作 为 内 参ꎬ 使 用 ＡＢＩ 图 １ ＢｎａＭＹＢ４ ＰＣＲ 扩增
ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ 荧光定量 ＰＣＲ 仪检测基因表达 Ｆｉｇ. １ ＢｎａＭＹＢ４ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
量ꎮ 针对 ＢｎａＭＹＢ 基因 ＯＲＦ 序 列 设 计 ｑＲＴ￣ＰＣＲ
特异引物如下:ＱＲＴ￣ＢｎａＭＹＢ￣Ｆ(５′￣ＴＣＧＣＴＴＡＴＴＧＣ ＭＹＢ４( ＫＡＪ０２２９９７０.１) 相似性为 ９４.５６％ꎬ与模式
ＴＧＧ ＧＡＧＡＴＴＡＣ￣３′)、 ＱＲＴ￣ＢｎａＭＹＢ￣Ｒ(５′￣ＧＴＴＧＧ 植物拟南芥的 ＡｔＭＹＢ４( ＮＰ ＿１９５５７４.１) 相似性为
ＡＴＣＡＡＴＣＣＣＴＣＧＧＴＴＴＡ￣３′)、Ａｃｔｉｎ７￣Ｆ(５′￣ＧＣＴＧＡＣ ８７.４１％ꎮ 这说明 ＢｎａＭＹＢ４ 在十字花科植物中具
ＣＧＴＡＴＧＡＧＣＡＡＡＧ￣３′)、 Ａｃｔｉｎ７￣Ｒ(５′￣ＡＡＧＡＴＧＧＡ 有较高 的 序 列 保 守 性ꎬ 并 且 成 功 克 隆 到 了 目 标
ＴＧＧＡＣＣＣＧＡＣ￣３′)ꎮ 反应体系(２０.０ μＬ):１０.０ μＬ 基因ꎮ
￣１
２× ＳＹＢＲ ｑＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘꎬ １. ０ μＬ ２０ ｎｇ μＬ ２.３ ‘南油 ８６８’ＭＹＢ４ 蛋白理化性质分析
￣１
ｃＤＮＡꎬ上、下游引物(１０.０ μｍｏｌＬ ) 各 ０.４ μＬꎬ 利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 工具对 ＢｎａＭＹＢ４ 蛋白的理化
ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ Ｗａｔｅｒ ８.２ μＬꎮ 扩增程序:９５ ℃ 预变性 性质 进 行 预 测ꎮ 结 果 显 示ꎬ 该 蛋 白 分 子 量 约 为
３０ ｓꎻ９５ ℃ ５ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 溶解曲线程 ３３.１０ ｋＤａꎬ等电点( ｐＩ) 为 ８.７８ꎬ表明其在生理 ｐＨ
序:９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃ ６０ ｓꎬ９５ ℃ １５ ｓ (以 ０.０５ ℃ 条件下可能带正电荷ꎮ 蛋白不稳定系数为 ４６.９８ꎬ
－１ －ΔΔＣＴ 法计算基因相对表达量 根据阈值( <４０ 为稳定)ꎬ提示该蛋白可能属于不
ｓ 速率升温)ꎮ 采用 ２
(Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００１)ꎮ 稳定蛋白ꎮ 总平均亲水性( ＧＲＡＶＹ) 为－０.６６２ꎬ表
明 ＢｎａＭＹＢ４ 为亲水蛋白ꎬ这与大多数可溶性转录
２ 结果与分析 因子的特性一致ꎮ
２.４ ‘南油 ８６８’ＭＹＢ４ 蛋白结构域、保守基序及系
２.１ ‘南油 ８６８’ＭＹＢ４ 转录因子克隆 统进化分析
以‘南油 ８６８’叶片 ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩 序列比对显示ꎬＢｎａＭＹＢ４ 与多数十字花科植
增ꎬ凝胶电泳显示片段约 ９００ ｂｐ (图 １)ꎬ与预期目 物 ＭＹＢ４ 氨基酸序列高度一致(图 ３)ꎬ系统进化树
的片段大小(８８５ ｂｐ) 相符ꎮ 回收该片段并测序ꎬ 分析(图 ４) 进一步表明ꎬＢｎａＭＹＢ４ 与甘蓝型油菜
结果显示序列全长为 ８８５ ｂｐ( 图 ２)ꎬ编码 １ 个由 自身的 ＭＹＢ４ 蛋白聚为一支ꎬ亲缘关系最近ꎬ其次
２９４ 个氨基酸组成的蛋白ꎬ命名为 ＢｎａＭＹＢ４ꎬ表明 与其他十字花科植物( 如萝卜、拟南芥) 的 ＭＹＢ４
已成功克隆到甘蓝型油菜品种‘ 南油 ８６８’ ＭＹＢ４ 聚在一起ꎬ而与山茶、辣椒等非十字花科植物的
基因的完整编码区序列ꎮ ＭＹＢ４ 亲缘关系较远ꎮ 该进化关系符合物种分类
２.２‘南油 ８６８’ ＭＹＢ４ 序列分析 规律ꎬ暗示 ＢｎａＭＹＢ４ 在功能上可能与十字花科近
对测序获得的 ＢｎａＭＹＢ４ 编码序列进行 ＢＬＡＳＴ 缘物种的 ＭＹＢ４ 更为相似ꎮ
分析ꎬ结果显示其编码的氨基酸序列与已报道的 保守结构域分析( 图 ５) 显示ꎬＢｎａＭＹＢ４ 含有
甘蓝型油菜 ＭＹＢ４ 蛋白( ＫＡＨ０８７１８７２.１) 相似性 典型 的 ＳＡＮＴ 结 构 域 ( 对 应 于 Ｒ２ 和 Ｒ３ 重 复 序
高达 ９８. ９７％ꎬ 与 灰 毛 山 芥 菜 ( Ｂａｒｂａｒｅａ ｇｒａｙｉ) 列)ꎬ 这是 Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ 转录因子的 ＤＮＡ 结合域ꎮ
