Page 30 - 《广西植物》2026年第6期

６ 期 鄢仲圻等: 神农架两种杓兰根际土壤及根内微生物的群落结构与多样性 ９ ４ ５

目前ꎬ关于杓兰属植物宿主与根际及根内微生物 ２０１９)ꎮ 取最终洗液涂布于 ＰＤＡ 和 ＬＢ 平板ꎬ２８ ℃
关系的系统研究仍较有限ꎮ 周珊(２０２０) 对扇脉杓 培养 ４８ ｈꎬ检测表面消毒是否彻底ꎮ 使用磁珠法
兰(Ｃｙｐｒｉｐｅｄｉｕｍ ｊａｐｏｎｉｃｕｍ)根内和根际真菌多样性 ＤＮＡ 提取试剂盒( 上海美吉逾华生物医药科技有
进行了分析ꎬ但不同宿主种类、生态位及发育阶段 限公司)抽提根际土壤和根样品的总 ＤＮＡꎮ 利用

下微生物群落的变化规律仍有待进一步明确ꎮ ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００ 检测 ＤＮＡ 浓度与纯度ꎬ并通过 １％
神农架地处北半球中纬度生物多样性热点地 琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 质量ꎮ
区ꎬ兰科植物资源丰富ꎬ其中杓兰属多达 １０ 种( 张 采 用 引 物 ＩＴＳ１Ｆ / ＩＴＳ２Ｒ 扩 增 真 菌 ＩＴＳ１ 区
成等ꎬ２０２５)ꎮ 绿花杓兰( Ｃ. ｈｅｎｒｙｉ) 和扇脉杓兰野 (Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９０)ꎮ ＰＣＲ 反 应 体 系 ２０ μＬ:２ ×
外种群数量有限ꎬ生境易受扰动ꎬ其保护与人工繁 Ｐｒｏ Ｔａｑ １０ μＬꎬ正、反向引物(５ μｍｏｌＬ ) 各 ０.８
￣１
育亟需根系相关微生物数据支撑ꎮ 因此ꎬ本研究 μＬꎬＤＮＡ 模板(１０ ｎｇμＬ ) １ μＬꎬ用无菌蒸馏水
￣１
以神农架地区的绿花杓兰和扇脉杓兰为研究对 补足至 ２０ μＬꎮ 反应程序为 ９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ３５
象ꎬ采用高通量测序技术ꎬ分析两种杓兰在不同发 个循环(９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ ５５ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃ 延
育阶段( 花期、果期) 与生态位( 根际、根内) 的真 伸 ４５ ｓ)ꎬ７２ ℃ 终延伸 １０ ｍｉｎꎮ 细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基
菌及细菌群落特征ꎬ探讨两种杓兰根际土壤与根 因 Ｖ３ － Ｖ４ 区 采 用 引 物 ３３８Ｆ / ８０６Ｒ 扩 增
内真菌、细菌群落是否随生态位和发育阶段发生 (Ｋｌｉｎｄｗｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ ＰＣＲ 反 应 体 系 同 上ꎮ
分化ꎬ并筛选与宿主种类、生态位或发育阶段相关 反应程序如下:９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ２９ 个循环(９５
的优势类群及潜在功能类群ꎬ以期为濒危杓兰属 ℃ 变性 ３０ ｓꎬ ５３ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓ)ꎻ７２
植物的保护与人工繁育提供微生物组学依据ꎮ ℃ 终延伸 １０ ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产物经 ２％琼脂糖凝胶电
泳检测并纯化ꎬ送上海美吉生物医药科技有限公
１ 材料与方法 司于 Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔｓｅｑ ２０００ 平台进行双端测序ꎮ 原
始 数 据 已 上 传 至 ＮＣＢＩ ＳＲＡ 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ: / /
１.１ 样品采集及处理 ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｓｒａ )ꎬ 登 录 号 为
于 ２０２５ 年 ４ 月( 花期) 和 ７ 月( 果期) 在湖北 ＰＲＪＮＡ１３９４５００ꎮ
神农架官门山景区(１１０.３８６°Ｅ、３１.４４３°Ｎꎬ海拔约 １.３ 数据处理与分析
１ ２００ ｍ) 同一地点采样ꎮ 在每个采样时期ꎬ均仅 利用 ｆａｓｔｐ(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)对原始数据进行
于该地点分别选取长势一致的绿花杓兰和扇脉杓 质控:去除接头序列ꎻ以滑动窗口法( ｗｉｎｄｏｗ ｓｉｚｅ ＝
兰各 １ 株进行采样ꎮ 本研究涉及的两种杓兰采 １０ ｂｐ)切除平均质量 Ｑ<２０ 的碱基ꎻ去除含 Ｎ 碱基
样ꎬ已取得神农架国家公园管理局审批许可ꎮ 根 的 ｒｅａｄｓꎻ保留长度≥５０ ｂｐ 的高质量序列ꎮ 使用
据 Ｇｅ 等(２０２１)的方法ꎬ用无菌毛刷收集紧贴根表 ＦＬＡＳＨ(Ｍａｇｏｃ ˇ ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇꎬ ２０１１) 进行双端序列拼
２ ｍｍ 以 内 的 根 际 土 壤ꎬ 剪 取 幼 嫩 根 段 ( 长 约 ３ 接:最小重叠长度 １０ ｂｐꎬ重叠区最大错配率 ０.２ꎮ
ｃｍ)ꎬ用无菌水冲洗以去除表面浮土及杂质ꎮ 本研 利用 ＵＰＡＲＳＥ 软件( Ｓｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ ＆ Ｇｏｅｂｅｌꎬ １９９４ꎻ
究共设置 ８ 个样品组ꎬ每组采集 ３ 份平行样品ꎬ共 Ｅｄｇａｒꎬ ２０１３)ꎬ按 ９７％相似度对序列进行操作分类
２４ 份ꎮ 各组平行样品均取自相应物种在对应时期 单元(ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔꎬ ＯＴＵ) 聚类ꎮ 微生
的同一植株ꎬ样品编号依据物种、发育阶段、植物 物群落 Ａｌｐｈａ 多样性选用 Ａｃｅ 指数衡量丰富度ꎬ

组织或土壤ꎬ即 ＣＨ(绿花杓兰)、ＣＪ( 扇脉杓兰)ꎬｂ Ｐｉｅｌｏｕ＿ｅ 指数反映均匀度ꎬＣｏｖｅｒａｇｅ 指数反映覆盖
(花期)、ｆ(果期)ꎬｒ( 根系)、ｓ( 根际土壤)ꎬ组合成 率ꎮ Ｂｅｔａ 多样性基于 Ｂｒａｙ￣Ｃｕｒｔｉｓ 距离进行非度量
共 ８ 个组( 具体编号及信息见表 １)ꎬ如 ＣＨｆｒ 表示 多维尺度分析( ｎｏｎ￣ｍｅｔｒｉｃ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｃａｌｉｎｇꎬ

绿花杓兰果期的根系样品ꎮ ＮＭＤＳ)ꎬ并通过置换多元方差分析( ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ
１.２ 总 ＤＮＡ 抽提及高通量测序 ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅꎬ ＰＥＲＭＡＮＯＶＡ) 检
根样品先经无菌水冲洗 ３ ｍｉｎ 后ꎬ用体积分数 验显著性水平( 置换次数为 ９９９)ꎮ 群落组成分析
７５％乙醇浸泡 １ ｍｉｎꎬ再用有效氯质量分数 ２％ 次 选用抽平后的 ＯＴＵ 表ꎬ绘制门水平柱状图( 合并
氯酸钠溶液浸泡 ３ ｍｉｎꎬ接着用体积分数 ７５％乙醇 丰度<１０)ꎬ基于 Ｖｅｎｎ 图中各组特有的 ＯＴＵ 绘制
浸泡 １ ｍｉｎꎬ最后用无菌水冲洗 ３０ ｓ( Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ 门水平趋势表、属水平 Ｈｅａｔｍａｐ 图(分类水平总丰