Page 26 - 《广西植物》2020年第4期

４ ６ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ) 凭借其多态性高、操作简 性系ꎬ开展了以杂交育种及种质资源评价为最终
单、易于分离测序ꎬ且多数标记在相关实验样本基 目的的华山松 ＳＲＡＰ 遗传标记分析ꎬ研究结果可为
因组 中 相 对 均 匀 分 布 的 特 点 ( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１ꎻ 该种子园内华山松种质资源的评价以及杂交育种
Ｔｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６)ꎬ目前在较多的林木遗传多样 时亲本的选配提供分子水平的理论与实践指导ꎮ

性分析中得到广泛应用( 张冬东ꎬ２００８ꎻ向晖等ꎬ
２０１６ꎻ陈 慧 等ꎬ ２０１７ꎻ 孟 慧 等ꎬ ２０１８ꎻ 张 安 世 等ꎬ １ 材料与方法
２０１８ꎻ姜武等ꎬ２０１９)ꎮ 赵杨等(２０１２) 对贵州平坝

华山松种子园无性系进行了 ＳＲＡＰ￣ＰＣＲ 反应体系 １.１ 材料来源
的优化ꎬ但未对其遗传多样性进行具体分析ꎮ 目 材料采集于云南省楚雄市紫溪山华山松种子
前ꎬ对华山松遗传多样性进行 ＳＲＡＰ 分析的相关研 园内 ６０ 个无病虫害的不同无性系新鲜幼嫩针叶ꎬ
究ꎬ国内外鲜见报道ꎮ 分别按无性系单株编号后装入自封袋ꎬ带回实验
针对云南省楚雄市紫溪山华山松种子园的生 室后置于 －８０ ℃ 冰箱ꎬ备用ꎮ 所有材料均来自云
产现状ꎬ实验选取 ６ 个种源共 ６０ 个华山松优良无 南省内的 ６ 个种源(表 １)ꎮ

表 １ ６０ 份华山松实验材料来源
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ ６０ Ｐｉｎｕｓ ａｒｍａｎｄｉｉ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ

无性系来源 经度 纬度 样本数 种源编号
Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｃｌｏｎｅ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ Ｌａｔｉｔｕｄｅ Ｓａｍｐｌｅ ｎｕｍｂｅｒ Ｐｒｏｖｅｎａｎｃｅ ｎｕｍｂｅｒ
会泽县 １０３°０３′—１０３°５５′ Ｅ ２５°４８′—２７°０４′ Ｎ １４ ＨＺ
Ｈｕｉｚｅ Ｃｏｕｎｔｙ
巍山县 ９９°５５′—１００°２５′ Ｅ ２４°５６′—２５°３２′ Ｎ １４ ＷＳ
Ｗｅｉｓｈａｎ Ｃｏｕｎｔｙ
腾冲市 ９８°０５′—９８°４５′ Ｅ ２４°３８′—２５°５２′ Ｎ １０ ＴＣ
Ｔｅｎｇｃｈｏｎｇ Ｃｉｔｙ
楚雄市 １００°３５′—１０１°４８′ Ｅ ２４°３０′—２５°１５′ Ｎ １０ ＣＸ
Ｃｈｕｘｉｏｎｇ Ｃｉｔｙ
南华县 １００°４４′—１０１°２０′ Ｅ ２４°４４′—２５°２１′ Ｎ ６ ＮＨ
Ｎａｎｈｕａ Ｃｏｕｎｔｙ
宜良县 １０２°５８′—１０３°２８′ Ｅ ２４°３０′—２５°１７′ Ｎ ６ ＹＬ
Ｙｉｌｉａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ

１.２ 总 ＤＮＡ 提取 Ｔａｑ Ｍｉｘ１２.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ９.５ μＬ、正向和反向引物各
２
取 ４ ~ ５ 根松针ꎬ采用改良的 ＣＴＡＢ 法ꎬ提取华 １ μＬꎮ 其 ＰＣＲ 扩增反应程序:９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４

山松基因组 ＤＮＡ( 谢冬梅等ꎬ２０１４)ꎮ 加入 ５０ μＬ ℃变性 １ ｍｉｎꎬ３７ ℃ 退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ５
ＴＥ ｂｕｆｆｅｒ 稀释所提取的 ＤＮＡ 至 ５０ ｎｇμＬ ꎬ然后 个循环ꎻ９４ ℃变性 １ ｍｉｎꎬ５３ ℃ 退火 １ ｍｉｎꎬ７２ ℃ 延
￣１
用 １％的琼脂糖凝胶电泳进行检测ꎬ并保存于－２０ 伸 １ ｍｉｎꎬ３０ 个循环ꎻ７２ ℃延伸 １０ ｍｉｎꎻ４ ℃保存ꎮ
℃ 冰箱中ꎮ １.４ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
１.３ ＳＲＡＰ￣ＰＣＲ 扩增 吸取 ６ μＬ ＰＣＲ 扩增产物和 ２ μＬ ６ × Ｌｏａｄｉｎｇ
实验扩增所用引物序列来自公开发表的相关 ｂｕｆｆｅｒ 混合后ꎬ加入到 ８％聚丙烯酰氨凝胶孔中进

报道(李正鹏等ꎬ２０１１ꎻ蔡元保等ꎬ２０１４)ꎮ 选择正向 行电泳 检 测ꎬ 电 压 设 为 ２３０ Ｖꎬ 电 泳 时 间 为 １５０
和反向引物各 １０ 条ꎬ随机组合后获得 １００ 对引物 ｍｉｎꎮ 电泳结束后进行凝胶的固定、染色和显影ꎬ
(表 ２)ꎮ 经初筛和复筛后成功筛选出 １５ 对多态性 拍照保存检测结果ꎮ
较好且 条 带 清 晰 的 ＳＲＡＰ 引 物 ( 表 ３)ꎮ 华 山 松 １.５ 数据处理
ＳＲＡＰ￣ＰＣＲ ２５ μＬ 反应体系:ＤＮＡ 模板 １ μＬ、Ｇｒｅｅｎ 将扩增得到清晰可辨的多态性条带ꎬ 作为参