Page 94 - 《广西植物》2020年第7期
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９ ９ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
期望为今后开展其抗逆功能研究奠定基础ꎮ 公司测序ꎬ获取目的基因中间片段序列ꎮ 根据克
隆测序获得的 ３ 个 ＡＯＸ 基因中间片段序列ꎬ设计
１ 材料与方法 ３′和 ５′ＲＡＣＥ 引 物 ( 表 １)ꎬ 采 用 巢 式 设 计ꎬ 通 过
Ｏｕｔｅｒ 和 Ｉｎｎｅｒ 两轮 ＰＣＲ 反应ꎬ对目的基因 ３′和 ５′
１.１ 材料 末端进行快速扩增ꎬ获得目的基因 ３′和 ５′端序列ꎮ
所用鹅掌楸( 种源为浙江松阳 ＳＹ) 叶片、茎、 将所获 得 的 中 间 片 段、３′ＲＡＣＥ 与 ５′ＲＡＣＥ 通 过
叶芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊和雌蕊组织材料均来 ＢｉｏＸＭ 软件进行电子拼接ꎬ并将拼接后的基因全
源于南京林业大学下蜀实习林场鹅掌楸种源试验 长在 ＮＣＢＩ 数据库中进行比对ꎬ利用在 ＮＣＢＩ 中的
林ꎬ样品采集后迅速放入液氮中速冷ꎬ后置于－ ８０ ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 在线预测基因的 ＯＲＦ 序列ꎬ根据预测
℃ 超低温冰箱中保存备用ꎮ 所用大肠杆菌感受态 的 ＯＲＦ 序列在其两端设计全长引物( 表 １)ꎬ进行
细胞 Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ＰＣＲ 扩增获得目的基因 ＯＲＦ 序列ꎮ
Ｃｅｌｌ、ｐＥＡＳＹ￣Ｔ１ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 和 ｐＥＡＳＹ￣Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ １.２.４ 基因的生物信息学分析 利用生物信息学
Ｋｉｔ 克隆载体购自北京全式金生物技术有限公司ꎮ 软件对获得的 ＡＯＸ 基因进行开放阅读框、编码的
１.２ 方法 氨基酸序列、蛋白质结构域及二级结构等分析ꎮ
１.２.１ 鹅掌楸 ＡＯＸ 家族基因 ＥＳＴ 序列的挖掘 对 通过 ＯＲＦ ｆｉｎｄｅｒ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｏｒ￣
北美 鹅 掌 楸 转 录 组 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ａｎｃａｎｇｉｏ. ｕｇａ. ｆｆｉｎｄｅｒ / )进行 ＯＲＦ 及编码氨基酸序列的预测ꎻ通
ｅｄｕ / ｃｏｎｔｅｎｔ/ ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ￣ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ) 进行检 索ꎬ搜 索 过 Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔ￣
到所有 ＡＯＸ 基因 ＥＳＴ 片段并导出ꎬ将本实验室测 ｐａｒａｍ / )进行蛋白质氨基酸组成、分子量、理论等
得的鹅掌楸转录组数据同北美鹅掌楸转录组数据 电点分析ꎻ使用 Ｐｆａｍ( ｈｔｔｐ: / / ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ / ) 进行
库中挖掘到的所有 ＥＳＴ 片段进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ筛 蛋白质结构域分析ꎻ采用在线工具 ＥｘＰＡＳｙ ＴＭｐｒｅｄ
选得到鹅掌楸 ＡＯＸ 同源基因 ＥＳＴ 片段ꎮ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｈ. ｅｍｂｎｅｔ. ｏｒｇ / ｓｏｆｔｗａｒｅ / ＴＭＰＲＥＤ ＿
１.２. ２ ＲＮＡ 提 取 和 ｃＤＮＡ 第 一 链 的 合 成 采 用 ｆｏｒｍ.ｈｔｍｌ) 分析蛋白质序列跨膜区ꎻ使 用 ＳｉｇｎａｌＰ
ＴＩＡＮＧＥＮ 公 司 的 植 物 总 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 ４. １ Ｓｅｖｅｒ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/
ＲＮＡｐｒｅｐ ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ(ＤＰ４３２) 提取鹅掌楸叶片、 ＳｉｇｎａｌＰ / )进行信号肽分析ꎻ使用 ＳＯＰＭＡ 进行蛋白
花瓣、雄蕊和雌蕊 ４ 个组织混合样品的 ＲＮＡꎮ 以 质二级结构预测ꎻ分别利用 ＴａｒｇｅｔＰ １.１ Ｓｅｒｖｅｒ( ｈｔ￣
提取的 ＲＮＡ 为模板ꎬ使用 Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴａｒｇｅｔＰ / ) 及
公司 反 转 录 试 剂 盒 ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ / ) 进行亚细胞定
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 进 行 ｃＤＮＡ 第 一 链 的 合 成ꎻ使 用 ３′￣ 位预测ꎻ在 ＮＣＢＩ 搜索下载已发表的 ＡＯＸ 同源序
ＴＭ 列进 行 分 析ꎬ 采 用 ＭＥＧＡ５. ０ 进 行 系 统 进 化 树
Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ ｗｉｔｈ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴａｓｅ(ＴａＫａ￣
Ｒａ) 试剂盒进行 ３′ＲＡＣＥ 反转录ꎻ用 ＳＭＡＲＴｅｒ 构建ꎮ
ＲＡＣＥ ５′ / ３′ Ｋｉｔ 试 剂 盒 ( ＴａＫａＲａ)ꎬ 进 行 ５′ＲＡＣＥ １.２.５ 基因的组织表达分析 提取鹅掌楸叶片、
反转录ꎬ在反转录前ꎬ重新检测所提取的 ＲＮＡ 完 茎、叶芽、花芽、花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊 ８ 个不同组
整性ꎬ保证 ＲＮＡ 无降解ꎮ 织的 ＲＮＡꎬ将提取的 ＲＮＡ 样品稀释到统一浓度
￣１
１.２.３ 基因全长 ｃＤＮＡ 序列的获取 以获取的 ＥＳＴ (２５０ ｎｇμＬ )ꎬ反转录呈 ｃＤＮＡꎮ 根据克隆获得
序列为基础ꎬ利用 Ｏｌｉｇｏ ７ 软件设计中间片段引物 ＬｃＡＯＸ１ａ、 ＬｃＡＯＸ１ｂ 和 ＬｃＡＯＸ２ 基 因 序 列ꎬ 采 用
(表 １)ꎬ以上一步获得的 ｃＤＮＡ 第一链为模板ꎬ进 Ｏｌｉｇｏ ７ 软件设计 ｑＰＣＲ 引物( 表 １)ꎬ用 Ａｃｔｉｎ９７ 作
行 ＬＡ Ｔａｑ( ＴａＫａＲａ) ＰＣＲ 扩增ꎬ扩增产物经 １.５％ 为内参基因ꎬ进行实时定量 ＰＣＲ 反应ꎬ检测目的基
的琼脂糖凝胶电泳检测后切取目的片段ꎬ回收、纯 因在 ８ 种不同组织中的表达量ꎬ每个样品设置 ３ 个
化并连接到 ｐＥＡＳＹ￣Ｔ１ 载体ꎬ转化 Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１ 感受 重复ꎬ反 应 体 系 和 程 序 参 照 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ
态ꎬ挑取阳性单克隆由南京金斯瑞生物科技有限 Ｔａｑ (Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ)(ＴａＫａＲａ)说明书ꎮ
ＴＭ
