Page 95 - 《广西植物》2020年第7期

７ 期 宗亚仙等: 鹅掌楸 ＡＯＸ 家族基因克隆与组织表达分析 ９ ９ １

表 １ 基因克隆及 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 扩增引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ＲＴ￣ｑＰＣＲ

退火温度
基因 引物类型 引物名称 序列 Ａｎｎｅａｌｉｎｇ
Ｇｅｎｅ Ｔｙｐｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ
(℃ )
ＬｃＡＯＸ１ａ 中间片段引物 ＬｃＡＯＸ１ａ￣Ｆ ＴＧＧＴＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＧＡＧＡＡＧ ５３
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＬｃＡＯＸ１ａ￣Ｒ ＡＣＣＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＧＣＡＴＴＧＡ
３′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ１ａ￣３Ｆ１ ＴＴＡＧＡＡＧＡＡＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＡＧ ５６
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ３′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ１ａ￣３Ｆ２ ＡＣＴＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＧＴＣＴＡＡＧＧ ６１
５′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ１ａ￣５Ｒ１ ＧＣＡＴＣＣＴＣＴＣＧＴＴＣＴＣＧＧＣＴＴＣＧＴＣ ６６
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ５′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ１ａ￣５Ｒ２ ＡＴＣＡＧＴＧＧＧＴＡＡＴＣＴＣＡＧＴＡＴＣ ５４
ＯＲＦ 引物 ＬｃＡＯＸ１ａ￣ＯＦ ＴＴＴＣＧＴＴＣＣＡＡＴＴＴＣＴＴＧＣＧＡＧＡＣＡ ６１
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＯＲＦ ＬｃＡＯＸ１ａ￣ＯＲ ＧＡＧＣＣＧＡＡＡＣＴＣＡＧＴＧＧＴＡＣＣＣＡＡ
实时荧光定量 ＰＣＲ 引物 ＬｃＡＯＸ１ａ￣ｑＦ ＡＴＧＴＴＣＣＡＧＣＣＡＣＡＴＴＧＴＣＧ ６０
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｑＰＣＲ ＬｃＡＯＸ１ａ￣ｑＲ ＧＡＡＴＣＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＣＴＴＧＣ
ＬｃＡＯＸ１ｂ 中间片段引物 ＬｃＡＯＸ１ｂ￣Ｆ ＡＣＧＴＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＡＧＣＣＡＡ ５２
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＬｃＡＯＸ１ｂ￣Ｒ ＡＴＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＣ
３′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ１ｂ￣３Ｆ１ ＡＧＧＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＡＡＴＧＣＡＴＡＴＴＴＣ ５９
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ３′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ１ｂ￣３Ｆ２ ＧＣＴＧＡＡＡＧＡＡＴＣＴＣＣＧＧＣＣＣＣＡＣ ６６
５′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ１ｂ￣５Ｒ１ ＧＡＧＴＧＣＣＴＴＴＡＴＣＣＡＴＣＣＧＣＣＧＣＴＧＴ ６９
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ５′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ１ｂ￣５Ｒ２ ＴＧＡＴＴＴＣＣＡＣＴＴＣＣＡＴＴＣＣＧ ５５
ＯＲＦ 引物 ＬｃＡＯＸ１ｂ￣ＯＦ ＡＴＧＡＡＣＴＣＣＡＡＡＣＴＡＧＣＧＡＣＡ ５５
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＯＲＦ ＬｃＡＯＸ１ｂ￣ＯＲ ＡＡＡＧＧＴＣＣＴＡＡＴＡＣＡＣＧＴＣＣ
实时荧光定量 ＰＣＲ 引物 ＬｃＡＯＸ１ｂ￣ｑＦ ＡＴＣＴＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＧＴＴ ６０
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｑＰＣＲ ＬｃＡＯＸ１ｂ￣ｑＲ ＴＣＴＡＡＣＡＴＣＡＴＧＧＣＣＣＧＡＣＡ
ＬｃＡＯＸ２ 中间片段引物 ＬｃＡＯＸ２￣Ｆ ＧＧＡＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＡＴＴＡＣＡＣＣ ５２
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＬｃＡＯＸ２￣Ｒ ＣＴＣＴＴＴＧＡＧＡＧＣＡＴＣＴＧＡＧＴＧ
３′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ２￣３Ｆ１ ＧＴＴＴＧＡＣＣＧＴＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣ ５５
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ３′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ２￣３Ｆ２ ＧＧＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＧＡＡＴＧＣＣＴＧ ６０
５′￣ＲＡＣＥ 引物 ＬｃＡＯＸ２￣５Ｒ１ ＣＡＡＡＴＡＡＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＣ ６１
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ５′￣ＲＡＣＥ ＬｃＡＯＸ２￣５Ｒ２ ＣＣＴＣＣＡＣＧＡＴＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＴ ５７
ＯＲＦ 引物 ＬｃＡＯＸ２￣ＯＦ ＣＣＣＴＡＡＣＴＣＴＡＧＡＴＣＧＧＣＡＡ ５６
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ＯＲＦ ＬｃＡＯＸ２￣ＯＲ ＴＣＡＡＴＧＧＴＡＣＣＣＡＡＣＴＧＧＡＧ
实时荧光定量 ＰＣＲ 引物 ＬｃＡＯＸ２￣ｑＦ ＡＴＣＴＧＡＣＡＡＡＧＣＡＣＣＡＴＧＴＣＣ ６０
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｑＰＣＲ ＬｃＡＯＸ２￣ｑＲ ＧＣＡＧＣＴＡＣＴＧＴＴＴＣＧＡＧＣＡＴＣ
内参引物 ＬｃＡＣＴ９７￣Ｆ ＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧ ６０
Ｐｒｉｍｅｒｓ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ＬｃＡＣＴ９７￣Ｒ ＴＧＧＴＣＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧ

中间片段特异性引物ꎬ通过 ＰＣＲ 扩增、目的片段回
２ 结果与分析 收以及克隆测序ꎬ对转录组中 ＡＯＸ 基因序列进行验

证(图 １:Ａ)ꎮ 根据中间片段测序结果设计 ＲＡＣＥ
２.１ 鹅掌楸 ＡＯＸ 家族基因 ｃＤＮＡ 全长序列克隆及 引物ꎬ采用巢式扩增ꎬ获得 ３′ＲＡＣＥ( 图 １:Ｃ) 和 ５′
命名 ＲＡＣＥ(图 １:Ｄ)ꎮ 将中间片段、３′ＲＡＣＥ 和 ５′ＲＡＣＥ
从北美鹅掌楸转录组数据库搜索到 ＡＯＸ 基因 进行电子拼接获得全长ꎬ并在其 ＯＲＦ 两端设计引物

相关的 ＥＳＴ 片段共 １６ 条ꎬ分别将其 ＥＳＴ 片段与本 进行 ＯＲＦ 验证(图 １:Ｂ)ꎬ表明拼接结果无误ꎮ 将克
实验室鹅掌楸转录组数据(Ｙａｎｇꎬ２０１３) 比对、去重 隆获得的 ３ 个 ＡＯＸ 基因预测蛋白通过 ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴ
之后ꎬ共得到 ３ 条鹅掌楸 ＡＯＸ 基因 ＥＳＴ 片段ꎬ分别 Ｐｒｏｔｅｉｎ 与数据库进行比对ꎬ根据比对结果ꎬ将获得
为 ｌｃｏｍｐ８４２０６＿ｃ０、ｌｃｏｍｐ９８７８９、ｌｃｏｍｐ９９８８０＿ｃ０ꎬ并 的目的基因依次命名为 ＬｃＡＯＸ１ａ(ＭＮ１８７９６６)、ＬｃＡ￣
根据筛选出的 ３ 条鹅掌楸 ＡＯＸ 基因 ＥＳＴ 序列设计 ＯＸ１ｂ(ＭＮ１８７９６８)和 ＬｃＡＯＸ２(ＭＮ１８７９６７)ꎮ