Page 93 - 《广西植物》2020年第7期

７ 期 宗亚仙等: 鹅掌楸 ＡＯＸ 家族基因克隆与组织表达分析 ９ ８ ９

ｖａｔｅｄ ａｒｅａ. Ａｓ ａ ｒｅｓｕｌｔꎬ ｓｅａｒｃｈｉｎｇ ｆｏｒ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｌ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ａｎｄ ｕｎｃｏｖｅｒｉｎｇ ｔｈｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｏｆ ｉｔｓ ｓｔｒｅｓｓ￣ｄｅｆｅｎｃｅ
ａｂｉｌｉｔｙ ａｒｅ ｇｒｅａｔ ｕｒｇｅｎｃｙ. Ｔｈｒｅｅ ＡＯＸ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ Ｌ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｂｙ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ａｎｄ ＲＡＣＥꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ ｉｎ ｓｉｌｉｃｏꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓꎬ ｅｎｃｏｄｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄｏ￣
ｍａｉｎｓꎬ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｓｏ ｏｎ. Ｔｈｅ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ｌｅｎｇｔｈ ｏｆ ＡＯＸ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ８５８ꎬ １ ０３２ ａｎｄ １ ０４４ ｂｐꎬ
ｗｈｉｃｈ ｅｎｃｏｄｅｄ ２８５ꎬ ３４３ ａｎｄ ３４７ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｗｅ ｎａｍｅｄ ｔｈｅ ｇｅｎｅｓ ａｓ ＬｃＡＯＸ１ａꎬ ＬｃＡＯＸ１ｂ ａｎｄ
ＬｃＡＯＸ２. Ｐｒｏｔｅｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｖｅａｌｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ＡＯＸ ｆａｍｉｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｌ. ｃｈｉｎｅｎｓｅ ｗｅｒｅ
ｈｉｇｈｌｙ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ａｔ ｔｈｅ Ｃ￣ｔｅｒｍｉｎｕｓꎬ ａｎｄ ａｌｌ ｔｈｅ ｔｈｒｅｅ ＡＯＸ ｇｅｎｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ “ＥＸＸＨ”ꎬ “ＥＥＥ￣Ｙ” ｉｒｏｎ￣ｂｉｎｄ￣
ｉｎｇ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｄｏｍａｉｎｓꎬ ｔｈｏｓｅ ｍａｙ ｈａｖｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｉｒｏｎ ｉｏｎｓ. Ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ＬｃＡＯＸ１ａ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｏｔｈｅｒ ｐｌａｃｅｓ ｏｕｔｓｉｄｅ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ. ＬｃＡＯＸ１ｂ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｌｏ￣
ｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ａｎｄ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａꎬ ｗｈｉｌｅ ＬｃＡＯＸ２ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｌｏｃａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍａｔｒｉｘ. Ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｓ ｏｆ ＡＯＸ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｅｘａｍｉｎｅｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｅｉｇｈｔ ｔｉｓｓｕｅｓꎬ ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ ｓｔｅｍꎬ ｌｅａｆꎬ ｌｅａｆ ｂｕｄꎬ ｆｌｏｗｅｒ ｂｕｄꎬ ｃａｌｙｘꎬ ｐｅｔａｌꎬ
ｓｔａｍｅｎｓ ａｎｄ ｐｉｓｔｉｌ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＲＴ￣ｑＰＣＲ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｔｙ (ＲＱ) ｏｆ ＬｃＡＯＸ１ａꎬ ＬｃＡＯＸ１ｂ ａｎｄ ＬｃＡＯＸ２
ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｆｌｏｒａｌ ｏｒｇａｎｓ ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｇｒｅａｔｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｉｎ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｏｒｇａｎｓ. Ｔｈｅ ＲＱ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＬｃＡＯＸ１ａ ａｎｄ ＬｃＡＯＸ１ｂ
ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｍｅｎｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｔｈｅ ＬｃＡＯＸ１ａꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔａｍｅｎｓ ｗａｓ ｍｕｃｈ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｏｔｈｅｒ ｔｉｓ￣
ｓｕｅｓ. Ｔｈｅ ＬｃＡＯＸ２ ｇｅｎｅ ｈａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ＲＱ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｅｔａｌｓ. Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｃｌｏｎｅｄ ｔｈｒｅｅ ＬｃＡＯＸ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎｓ ａｎａｌｙｓｉｓ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ
ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓꎬ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｏｘｉｄａｓｅꎬ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎꎬ ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ

高等植物线粒体有两条重要的电子传递途 察到交替呼吸增强ꎬ且转 ＡＯＸ 基因植物对胁迫适
径:细胞色素途径和交替途径( 也称抗氰呼吸途 应 能 力 有 显 著 提 高 ( Ｃｈｉｎｎｕｓａｍｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７ꎻ
径)ꎮ 正常情况下植物以细胞色素途径为主:通过 Ｄｏｒｏｔｅｉａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎻ Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ꎻ Ｋｅｕｎｅｎ ｅｔ
一系列电子传递复合体ꎬ最终将电子传递给氧而 ａｌ.ꎬ２０１６)ꎮ
形成水ꎬ产生的化学能同 Ｆ Ｆ ￣ＡＴＰａｓｅ 偶联形成 木兰 科 ( Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ) 鹅 掌 楸 ( Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ
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ＡＴＰꎬ但该过程中电子传递途径上有三个磷酸化部 ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)为第三纪孑遗树种ꎬ是被子植物中最原
位ꎬ对氰化物敏感ꎮ 在植物受到逆境胁迫时细胞 始的类群之一ꎮ 鹅掌楸又名马褂木ꎬ为中国特有
色素途径被抑制而交替途径增强:交替途径是一 树种ꎬ天然更新能力差ꎬ种子繁殖适合度低ꎬ自然

条从泛醌库开始分支并以交替氧化酶( ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ 群落中种群数量小ꎬ种群内个体数目少ꎬ且星状分
ｏｘｉｄａｓｅꎬＡＯＸ) 为末端氧化酶的电子传递途径ꎬ电 布于我国西南、中东及越南北部ꎬ群体间基因交流
子从还原状态的泛醌直接传递给分子氧形成水ꎬ 受到严重影响ꎬ处于濒危状态ꎬ现已被列入国家二
能量以 热 能 形 式 散 失 ( Ｖａｎｌｅｒｂｅｒｇｈｅ ＆ Ｍｃｉｎｔｏｓｈꎬ 级珍 稀 濒 危 保 护 植 物 名 录 ( 郝 日 明 和 贺 善 安ꎬ
１９９７)ꎮ 现有的研究结果表明ꎬ植物在逆境胁迫影 １９９５)ꎮ 鹅掌楸作为从裸子植物向被子植物过渡
响下ꎬＡＯＸ 基因表达量显著提高ꎬ细胞内 ＡＯＸ 蛋 的树种ꎬ对研究有花植物的起源、分布和系统发育
白丰度显著提高来应对不良环境对细胞造成的损 有重要价值(李康琴ꎬ２０１３)ꎬ且作为优良的园林观
伤ꎮ Ｂｏｎｎｅｒ ＆ Ｒｉｃｈ(１９８６)首次从天南星科斑叶阿 赏及高档家具用材树种ꎬ有着非常重要的经济价

诺母( Ａｒｕｍ ｍａｃｕｌａｔｕｍ) 线粒体中分离得到 ＡＯＸꎬ 值ꎮ 拥有广泛的适应性是一个树种推广利用的前
并确定该 蛋 白 与 其 开 花 产 热 有 关ꎮ Ｚａｌｕｔｓｋａｙａ ｅｔ 提ꎬ因此ꎬ从林木遗传改良角度ꎬ挖掘和研究抗性
ａｌ.(２０１５)在对衣藻( Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ) 热 相关基因、提高鹅掌楸适应性对于鹅掌楸抗性育
处理后交替呼吸显著增强ꎬＡＯＸ１ 基因表达量上 种具有重要意义ꎮ 因此ꎬ本文以鹅掌楸为研究对
调ꎮ 此外ꎬ在对拟南芥冷处理、干旱胁迫处理ꎬ以 象ꎬ利用 ＲＡＣＥ 技术筛选并克隆鹅掌楸 ＡＯＸ 家族
及对蒺藜苜蓿盐胁迫处理等逆境条件处理下均观 基因ꎬ进行生物信息学分析ꎬ组织表达特性分析ꎬ