Page 14 - 《广西植物》2021年第8期
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ϟ ԰ ԰ ऐ                                广জ 西জ 植জ 物                                         ࿗ϟ 卷
            试ᖔ以期获得黄梁木维管组织 ሕ 种不同类型的细                            示ᤥ 透明后ᖔ将每种处理取 ሕ 个小茎段在通风橱
            胞ྉ形成层细胞ܦ韧皮部细胞和木质部细胞ɯ 与高                            风干 ϟԡ ቝᔽႿᖔ放入 ϟ঎ጢ ቝᓂ ኏શዶ᥋஦ʢᔀᔀ 离心管ᖔ液氮速
            质量 ኏શዶᖔ建立适合黄梁木维管组织的 ᓂᥘ᧕ 体                          冻ᖔ进行磨样和 ኏શዶ 提取ᖔ通过琼脂糖凝胶电泳
            系ᖔ为后续进行 ሕ 种不同类型细胞发育的转录组                            检测 ኏શዶ 完整性ᤥ
            分析提供材料ᖔ也为进一步挖掘参与黄梁木维管                              ϟ঎԰঎࿗ 渗蜡জ 渗蜡是石蜡逐步替代透明剂的过程ᖔ
            组织发育的关键基因ᖔ探究林木树种速生性状和                              通过梯度处理和温度及时间控制ᖔ最终石蜡渗透
            木材品质遗传改良奠定基础ᤥ                                      整个组织ᖔ为石蜡包埋和后续切片奠定基础ᤥ 渗
                                                               蜡步骤如下᧥ྉϟɯ 透明剂与石蜡按照 ϟᨒ ϟ 的比例
            ϟজ 材料与方法                                           ྉጢԡᠮ正丁醇 ᣰጢԡᠮ石蜡或 ጢԡᠮ异丙醇 ᣰጢԡᠮ石蜡ɯ
                                                               ᤃጢ ቩ 处理 ϟ ၤଫྉ԰ɯϟԡԡᠮ的纯蜡 ᤃጢ ቩ 处理 ϟጲϟ঎ጢ
            ϓॹϓ 实验材料                                           ၤଫྉሕɯϟԡԡᠮ的纯蜡 ᤃጢ ቩ 处理 ԰ጲ԰঎ጢ ၤᖔ԰ 次ᤥ
                 供试材料黄梁木种子采自华南农业大学校园                           ϟ঎԰঎ጢ 包埋ܓ切片与脱蜡জ 将含有样品的石蜡迅速
            内 ϟԡ 年生黄梁木母树ᖔ成熟种子经无菌水浸泡ᖔ                           倒入用牛皮纸折叠好的包埋盒内ᖔ牛皮纸提前高
            于 ϟ԰ԡ ʢኼቝᔽႿ 的恒温摇床上 ࿗ԡ ቩ 温育过夜ᖔ之后                    压灭菌且用 ኏શᑕ༁ᔀԻᑕᡱ 擦拭ᖔ去除 ኏શᑕ༁ᔀ༁ 污染ଫ用
                         ᥋ϟ
            经 Ꭾጢᠮ乙醇中浸泡 ሕԡ ༁ 进行表面灭菌ᖔ无菌水冲                        干净且高温的镊子将样品在包埋盒里定位ᖔ待石
            洗 ሕ 次后用 ጢᠮ次氯酸钠浸泡 ϟጢ ቝᔽႿᖔ无菌水中冲                      蜡冷却凝固后ᖔ放入 ࿗ቩ 冰箱保存ᤥ 用单面刀片
            洗 ሕ 次ᤥ 将经过灭菌处理的种子在无菌滤纸上吸                           将包埋好的蜡块修成规整的矩形ᖔ粘在小木块上ᖔ

            干ᖔ并植入 ᥘ୩ 基础培养基ྉ ᓂᔽ ᔀᡷ ᑕ᤟঎ᖔ԰ԡϟँɯᤥ ࿗ԡ ʛ              上机切片ᖔ切片厚度 ϟ࿗ ဂቝᤥ 切片使用到的毛刷ܦ
            后可获得第一代小植株ᖔ选出其中 ϟ 棵小植株接                            镊子ܦ刀片等均经过高压灭菌和 ኏શᑕ༁ᔀԻᑕᡱ 擦拭ᖔ
                                          ᥋ϟ             ᥋ϟ
            种于增殖培养基ྉᥘ୩շԡ঎ϟ ቝ੫ኼᓂ શዶዶշϟቝ੫ኼᓂ                      去除 ኏શᑕ༁ᔀ༁ 污染ଫ 石蜡切片 机ᖔ 烤片机等先用
            ᤃ᥋ାዶɯ培养ᖔ以获得遗传背景一致的植物作为实验                           Ꭾԡᠮ乙醇灭菌ᖔ再用 ኏શᑕ༁ᔀԻᑕᡱ 擦拭ᤥ 切好的蜡带
            材料ᤥሕԡ ʛ 后ᖔ切取无性扩繁的幼嫩侧芽ྉ 含茎                          放在 ࿗԰ ቩ ᧕ጶ۪ऊ 水ྉϟᠮ焦炭酸二乙酯ɯ 上伸展ᖔ
            段ɯ接种于生根培养基ྉᥘ୩շԡ঎ϟ ቝ੫ኼᓂ શዶዶɯᖔ诱                      用载玻片将蜡带从 ᧕ጶ۪ऊ 水中取出ᖔ平展在玻片
                                                ᥋ϟ
            导生根ᖔ从而形成完整植株ᤥ 经过炼苗处理后的                             上ᖔ并放在烤片机 ࿗԰ ቩ 烘烤ᖔ直到水分蒸发完全ᤥ
            植株移栽到浸润的泥炭土中ᤥ 待苗高 ጢԡ ዹቝ 左右                         将烘干后的组织玻片经过 ԰ 次二甲苯脱蜡ᖔ每次

            ྉ约 ࿗ 个月ɯᖔ取其第二茎节作为后续实验材料ᤥ                           ϟԡ ቝᔽႿଫ脱蜡完成后ᖔ将组织玻片于通风橱中至二
            ϓॹԣ 石蜡切片                                           甲苯完全挥发ᖔ并进行形态学观察ᤥ
            ϟ঎԰঎ϟ 固定জ 取生长旺盛的黄梁木第 ԰ 茎节ᖔ剪除                       ϓॹᇺ 激光显微切割
            叶片ᖔ用锋利的单面刀片切成 ԰ጲሕ ቝቝ 的小茎段ᖔ                             使用 ᓂᔀᔽዹᑕ ዶ୩ ᓂᥘ᧕ Ꭾԡԡԡ 对靶细胞进行切割
            单面 刀 片 提前高压灭菌并用 ኏શᑕ༁ᔀԻᑕᡱ ྉ 购自                      收集ᖔ在激光显微切割前用 ኏શᑕ༁ᔀԻᑕᡱ 对承载玻片
            ఋၤᔀʢቝᆍ èᔽ༁ၤᔀʢ ୩ዹᔽᔀႿᡷᔽ஦ᔽዹ 公司ɯ擦拭ᖔ去除 ኏શᑕ༁ᔀ༁ 污         和收 集管的载物台进行擦拭ᤥ 对放大倍数
            染ᖔ立即投入含有固定液的 ϟጢ ቝᓂ ኏શዶ᥋஦ʢᔀᔀ 离心                     ྉቝᑕ੫Ⴟᔽ஦ᔽዹᑕᡷᔽᆍႿɯܦ 激光能量 ྉ ᡱᆍऔᔀʢ ɯܦ 切割速度
            管中ᖔ固定剂提前预冷备用ᤥ 固定剂处理见表 ϟᤥ                           ྉ༁ᡱᔀᔀʛɯܦ 激光切割 孔 径 ྉᑕᡱᔀʢᡷࣼʢᔀ ɯܦ 脉冲频率
            固定后ᖔ将每种处理取 ሕ 个小茎段在通风橱风干                            ྉᡱࣼ᤟༁ᔀ ஦ʢᔀीࣼᔀႿዹᢃɯ 和发射强度ྉ ၤᔀᑕʛ ዹࣼʢʢᔀႿᡷɯ 等参
            ϟԡ ቝᔽႿᖔ放入 ϟ঎ጢ ቝᓂ ኏શዶ᥋஦ʢᔀᔀ 离心管ᖔ液氮速冻ᖔ                数进行调试ᖔ建立黄梁木幼苗茎段维管组织细胞
            进行磨样和 ኏શዶ 提取ᖔ通过琼脂糖凝胶电泳检测                           最佳切割参数ᤥ
            ኏શዶ 完整性ᤥ
            ϟ঎԰঎԰ 脱水জ 固定后ᖔ进行组织脱水处理ᤥ 脱水剂                        ԰জ 结果与分析
            选用乙醇和正丁醇ᤥ 根据脱水剂不同所选择的脱

            水梯度ܦ脱水温度以及脱水时间也不同ྉ 表 ԰ɯᤥ                           ԣॹϓ 不同固定剂处理结果
            根据脱水效果来选用最优的脱水剂及脱水步骤ᤥ                                  固定剂的选择是目标产物获得的关键ᤥ 本研
            ϟ঎԰঎ሕ 透明জ 脱水后ᖔ进行组织透明处理ᤥ 透明剂                        究选择 ሕ 种固定剂对材料进行固定处理ᖔ丙酮固
            种类ܦ透明梯度ܦ透明温度以及透明时间如表 ሕ 所                           定剂处理后的 ኏શዶ 凝胶电泳图见图 ϟᤥ 由图 ϟ᧥ዶ
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