Page 155 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 周璇等: 垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 基因克隆及干旱胁迫下的表达分析 ３ ４ ９

垫状卷柏(Ｓｅｌａｇｉｎｅｌｌａ ｐｕｌｖｉｎａｔａ) 又名九死还魂 足水分)ꎮ 各处理组选取 ６ 个长势一致的植株ꎬ３
草ꎬ主要分布于我国的干旱地区ꎬ常生长于裸露的 个生物学重复ꎬ每个处理后的样本液氮速冻于－８０
石灰岩表面或者石缝中ꎬ具有很强的耐旱性ꎬ属于 ℃ 保存ꎮ
蕨类植物门垫状卷柏科垫状卷柏属土生或石生的 １.２ 方法
复苏植物(吴征镒ꎬ２００４)ꎮ 研究表明ꎬ垫状卷柏具 １.２.１ ＳｐＬＥＡ１ 基因 ＤＮＡ 的克隆 垫状卷柏总 ＤＮＡ
有独特的活性氧生成和清除调节途径ꎬ增强脱落酸 的提取按照小量植物(叶)总 ＤＮＡ 抽提试剂盒( 北
生物合成和潜在的调节脱落酸信号及对脱落酸响 京天根生化公司) 的说明书提取ꎮ 根据本实验室
应的机制ꎬ且经过叶绿体基因组分析发现其叶绿体 转录组测序结果ꎬ设计 ＳｐＬＥＡ１ 基因全长引物( 表
结构具有独特的重排且叶绿体 ＮＡＤ( Ｐ) Ｈ 脱氢酶 １)ꎬ 以 垫 状 卷 柏 ＤＮＡ 为 模 板ꎬ 进 行 ＰＣＲ 扩 增ꎮ
(ＮＤＨ)基因完全缺失(Ｓａｕｃｅｄｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 因为 ＰＣＲ 反 应 体 系: ＤＮＡ 模 板 ２. ０ μＬ、 ２ × Ｔａｑ ＰＣＲ

ＬＥＡ１ 蛋白可在植物幼苗时期受干旱、盐胁迫、ＡＢＡ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ １６ μＬ、上下游引物各 １.０ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ２０
２
以及低温胁迫诱导表达ꎬ并且对植物体内乳酸脱氢 μＬꎬ终体积 ４０ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增程序:９４ ℃ ꎬ预变性ꎬ
酶的活性有保护作用ꎬ同时可正向调控部分钙依赖 ２ ｍｉｎꎻ９４ ℃ ꎬ变性ꎬ３０ ｓꎬ５７ ℃ ꎬ退火ꎬ３０ ｓꎬ７２ ℃ ꎬ
性蛋白 激 酶 的 表 达 ( 邹 永 东ꎬ ２０１１ꎻ Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ 延伸ꎬ９０ ｓꎬ３８ 个循环ꎻ７２ ℃ ꎬ延伸ꎬ１０ ｍｉｎꎻ４ ℃ 保
２０１８)ꎬ所以 ＬＥＡ１ 蛋白作为参与植物耐受性调控的 存ꎮ 使用 １％琼脂糖凝胶电泳检测并使用凝胶回
重要蛋白在高耐旱植物垫状卷柏中发挥的作用值 收试剂盒( ＯＭＥＧＡ 公司) 纯化 ＰＣＲ 产物ꎬ连接到
得探究ꎮ 但是目前ꎬ有关蕨类植物 ＬＥＡ 蛋白的研究 克隆载体 ＰＭＤ１８￣Ｔ( 宝日医生物技术) 中ꎬ转化大
较少ꎬ而在蕨类植物垫状卷柏中 ＬＥＡ１ 基因的研究 肠杆菌(Ｅ. ｃｏｌｉ) ＤＨ５α(天根生化生物公司)ꎬ经菌
几乎为空白ꎮ 因此ꎬ在垫状卷柏中克隆 ＬＥＡ１ 基因 液 ＰＣＲ 鉴定后送生工生物工程股份有限公司进行
并分析其分子机制及表达特征ꎬ对其在垫状卷柏抗 测序ꎮ
旱过程中的调控机制进行深入研究具有重要意义ꎮ １.２.２ ＳｐＬＥＡ１ 基因 ｃＤＮＡ 的克隆 垫状卷柏的总
本 研 究 分 离 克 隆 了 垫 状 卷 柏 ＳｐＬＥＡ１ 基 因ꎬ 对 ＲＮＡ 按照总 ＲＮＡ 提取试剂盒( ＯＭＥＧＡ 公司) 的
ＳｐＬＥＡ１ 基因序列及启动子顺式作用元件进行了生 说明书提取ꎮ 参照逆转录试剂盒( 全式金生物技
物信息学分析ꎬ构建了系统发生树和遗传距离矩 术有限公司)的使用说明书方法ꎬ使用提取的 ＲＮＡ
阵ꎬ对同源蛋白序列进行了比对ꎬ并利用实时荧光 作为模板进行逆转录反应ꎮ 以垫状卷柏 ｃＤＮＡ 第
定量技术检测了垫状卷柏幼嫩叶片不同干旱状态 一链为模板ꎬ进行 ＰＣＲ 扩增( 引物、ＰＣＲ 反应体系
下的表达情况ꎬ可为进一步探索 ＳｐＬＥＡ１ 基因在干 和程序同 １.２.１ 相同)ꎬ转化克隆、测序ꎬ获得 ｃＤＮＡ
旱胁迫下的功能及分子作用机制奠定基础ꎬ同时ꎬ 全长ꎮ
也可为园林园艺观赏植物的抗旱性改良提供基因 １.２.３ ＳｐＬＥＡ１ 基 因 启 动 子 的 克 隆 以 垫 状 卷 柏
资源ꎮ ＤＮＡ 为模板ꎬ结合 ＬＥＡ１ 基因序列设计启动子特异
引物 ＳｐＬＥＡ１Ｑ１ / ２ / ３ꎬ分别作为第一、第二、第三轮
１ 材料与方法 特异引物ꎬ依次与随机引物组合ꎬ进行 ＨｉＴａｉｌ￣ＰＣＲ
扩增ꎬ 随 机 引 物 采 用 Ｌｉｕ 和 Ｃｈｅｎ ( ２００７) 设 计 的
１.１ 材料及处理 ＬＡＤ１￣１ / ２ / ３ / ４(表 １)ꎮ 选择第三轮产物进行电泳
垫状卷柏采于云南省昆明市郊区ꎬ采集后进 检测ꎬ将切取目的条带进行连接、转化、克隆后送

行培养箱培养(１６ ｈ 日照ꎻ２５ ℃ ꎻ相对湿度 ２０％)ꎮ 去测序ꎮ
采用垫状卷柏新鲜枝叶提取 ＤＮＡ 和 ｃＤＮＡꎻ基因 １.２.４ 生物信息学分析 利用 ＥｘＰＡＳｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ
表达分析采用从岩石表层采集植株根部土壤含量 (ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 分 析 氨 基 酸
较低的垫状卷柏植株ꎬ对实验材料根部充分浇水 的 理 化 性 质ꎻ 利 用 Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ ( ｈｔｔｐ:/ / ｌｉｎｕｘ１.
后ꎬ进行自然干旱处理ꎬ在处理时间点进行新鲜幼 ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ. ｃｏｍ/ ｂｅｒｒｙ.) 分 析 基 因 的 结 构 信 息ꎻ 利 用
嫩枝叶采集ꎬ分为 ６ 个处理组ꎬ分别为 ０ ｈ(根部充 ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１ Ｓｅｒｖｅｒ(ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ/ ｓｅｒｖｉｃｅｓ/
分着水ꎬ对照组)、自然干旱 ２、４、１２、２４ ｈ 和 ２４ ｈ ＮｅｔＰｈｏｓ/ )预测磷酸化位点ꎻ利用 Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ(ｈｔｔｐｓ:/ /
后复水 ２ ｈ 组( 复水组在干旱 ２４ ｈ 后立即给予充 ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ ｐｒｏｔｓｃａｌｅ/ )分析蛋白亲/ 疏水性ꎻ利用