Page 156 - 《广西植物》2023年第2期
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３ ５ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ/ ｎｐｓａ ＿ ＳｐＬＥＡ１￣Ｆ / Ｒ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ经测序鉴定获得全长
ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ)进行二级结构预 ４７５ ｂｐ 的 ＳｐＬＥＡ１ 基 因ꎮ 以 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 采 用
测 及 分 析ꎻ 利 用 Ｓｗｉｓｓ￣Ｍｏｄｅｌ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ＳｐＬＥＡ１￣Ｆ / Ｒ 为引物ꎬ克隆获得 ２７９ ｂｐ 的 ＳｐＬＥＡ１
ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ/ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ) 通 过 同 源 建 模 建 立 三 级 模 基 因 ｃＤＮＡ 序 列 ( 图 １: Ａ)ꎮ 测 序 结 果 表 明ꎬ
型ꎻ利用 ＤＮＡＭＡＮ９ 软件获得多序列结构域比对 ＳｐＬＥＡ１ 基因含有 １ 个内含子(１９６ ｂｐ)和 ２ 个外显
图并分析遗传距离矩阵ꎻ利用 ＭＥＧＡ Ｘ 软件构建 子(１１５ ｂｐ 和 １６４ ｂｐ)ꎬｃＤＮＡ 长度为 ２７９ ｂｐꎬ编码
系统进化树ꎻ利用在线软 件 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( ｈｔｔｐｓ: / / ９２ 个氨基酸( 图 １:Ｂ)ꎮ 根据 ＮＣＢＩ 的 ＰＦＡＭ 数据
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔ￣ｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ ｐｌａｎｔｃａｒｅ / 库查询ꎬ得到 ＳｐＬＥＡ１ 蛋白在 ２ ~ ８８ 氨基酸位点含
ｈｅｍｌ/ )对启动子顺式作用元件进行分析ꎮ 有保守结构域 ＬＥＡ￣５ꎬＰＦＡＭ 号是 ＰＦ００４７７ꎬ表明
１.２.５ ＳｐＬＥＡ１ 的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 表达 利用 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 技 垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 基因属于 ＬＥＡ１ 家族ꎮ
术分析垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 基因在干旱胁迫处理下 通 过 ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣
的表达ꎬ根据获得的垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 基因序列设 ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ) 在线
计一对 ＳｐＬＥＡ１ 定量 ＰＣＲ 引物ꎬ以卷柏 Ａｃｔｉｎ 为内 预测垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 蛋白质二级结构ꎬ由图 １:Ｃ
可知ꎬα￣螺旋占 ４０.２２％ꎬβ￣转角占 １８.４８％ꎬ无规则
参基因( 表 １)ꎬ以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ利用 ＴＢ Ｇｒｅｅｎ
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ⅱ说明书( ＴａｋａｒａꎬＲＲ８２０Ａ) 进行 卷曲占 ３６.９６％ꎬ延伸链占 ４.３５％ꎬ采用 Ｓｗｉｓｓ￣Ｍｏｄｅｌ
ＴＭ
ｑＲＴ￣ＰＣＲ 分析ꎬ每个样品 ３ 次重复以减小误差ꎬ反 (ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ) 在 线 工
具进 行 同 源 建 模ꎬ 预 测 其 三 级 结 构ꎮ 垫 状 卷 柏
应程序:９５ ℃ ꎬ预变性ꎬ３０ ｓꎻ９５ ℃ ꎬ变性ꎬ５ ｓꎬ６０
℃ ꎬ退火ꎬ３０ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 每个样品设有 ３ 次重 ＳｐＬＥＡ１ 蛋白主要由 α￣螺旋和无规则卷曲构成ꎬβ￣
－△△Ｃｔ 转角和延伸链占比较小ꎮ
复ꎬ采用 ２ 法ꎮ
２.２ ＳｐＬＥＡ１ 的生物信息学分析
表 １ 本研究所用引物序列 通 过 ＥｘＰＡＳｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. ｅｘｐａｓｙ.
ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ/ ｐｒｏｔｐａｒａｍ.ｈｔｍｌ)预测分析ꎬ ＳｐＬＥＡ１ 基因编
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
码蛋白质相对分子量为 ９ ４９１.４６ Ｄａꎬ理论等电点
名称 引物序列 (５′→３′)
Ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′) ５.４５ꎬ分子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ带负电荷(Ａｓｐ ＋
３９７ ６５９ １２３ １４２ ２
Ｇｌｕ)的残基总数为 １６ꎬ带正电荷(Ａｒｇ ＋ Ｌｙｓ)的残基
ＳｐＬＥＡ１￣Ｆ ＡＴＧＧＣＴＴＣＴＧＣＡＣＡＧＧＡＡＡＡＧ
总数为 １４ꎮ 不稳定指数为 ２８.７２ꎬ该蛋白为稳定蛋
ＳｐＬＥＡ１￣Ｒ ＴＴＡＡＴＣＡＧＴＣＴＴＣＴＴＡＡＡＣＴＴＧＣ
ＳｐＬＥＡ１Ｑ１ ＣＴＣＡＴＣＧＡＴＧＴＣＡＡＴＣＣＣＡＣＧＣ 白ꎮ ＳｐＬＥＡ１ 蛋白含有 Ｔｈｒ(４.３％)、Ｌｙｓ(９.８％)、Ｇｌｎ
ＳｐＬＥＡ１Ｑ２ ＣＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＡＡＣＴＧＣＴＣＴＧ (５.４％)、Ｇｌｙ(１８.５％)、Ｇｌｕ(１３.０％) 亲水性氨基酸ꎬ
ＳｐＬＥＡ１Ｑ３ ＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＣＣＴＴＴＣＣＴＧＣＧ 还含有 Ａｌａ(１２.０％)、Ｍｅｔ(２.２％)ꎬＶａｌ(３.３％)、Ｉｌｅ
(３.３％)、Ｌｅｕ(６.５％) 疏水性氨基酸ꎮ 经计算ꎬ亲水
ＱＲＥＪＥＭ￣１ ＣＡＧＣＡＣＡＧＧＧＣＡＧＡＧＣＡＧＴＴＡＧ
性氨基酸占 ５１％ꎬ疏水性氨基酸占 ２７.４％ꎬ平均亲水
ＱＲＴＪＥＭ￣２ ＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＧＣＡＣＣＡＧ
指数为－０.８３８ꎮ
ＳｍＡＦ ＣＣＡＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡ
通 过 Ｐｒｏｔｓｃａｌｅ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｘｐａｓｙ. ｃｈ / ｔｏｏｌｓ/
ＳｍＡＲ ＣＡＣＣＧＣＣＴＧＡＡＴＡＧＣＡＡＣＧＴ
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ.ｈｔｍｌ)在线预测分析垫状卷柏 ＳｐＬＥＡ１ 蛋
ＬＡＤ１￣１ ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＶＮＶＮＮＮＧＧＡＡ
白的亲 / 疏水性ꎮ 结果表明ꎬ小于 ０ 的亲水性氨基
ＬＡＤ１￣２ ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＢＮＢＮＮＮＧＧＴＴ
酸占多数ꎬ大于 ０ 的疏水性氨基酸只占少数ꎬ在第
ＬＡＤ１￣３ ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＶＶＮＶＮＮＮＣＣＡＡ
６８ 位氨基酸有最大值为 ０.８９２ꎬ该处疏水性最强ꎬ
ＬＡＤ１￣４ ＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＡＧＣＧＧＣＣＧＣＢＤＮＢＮＮＮＣＧＧＴ
在第 ４３ 位氨基酸有最小值为－２.４３３ꎬ该处亲水性
最强(图 ２)ꎬ说明 ＳｐＬＥＡ１ 蛋白属于亲水性蛋白ꎮ
２ 结果与分析 利 用 ＮｅｔＰｈｏｓ ３.１ Ｓｅｒｖｅｒ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ.
ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＮｅｔＰｈｏｓ/ ) 在 线 预 测 发 现 ＳｐＬＥＡ１
２.１ ＳｐＬＥＡ１ 基因的克隆 蛋白发生磷酸化修饰的位点共有 １０ 个ꎮ 其中ꎬ丝
以 垫 状 卷 柏 总 ＤＮＡ 为 模 板ꎬ 结 合 引 物 氨酸有 ６ 个 (Ｓｅｒｉｎｅ 位点为 ３、２９、５７、６６、６７、８６)ꎬ
