Page 114 - 《广西植物》2020年第5期

７ １ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷

表 １ 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶纯化结果
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ
总酶活性 总蛋白含量
体积 提纯倍数 回收率
样品 Ｔｏｔａｌ ｅｎｚｙｍｅ Ｔｏｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ
Ｖｏｌｕｍｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ
Ｓａｍｐｌｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｃｏｎｔｅｎｔ
(ｍＬ) ｍｕｌｔｉｐｌｅ (％)
(Ｕ) (ｍｇ)
粗酶液 １００ １ ３２０ １２９.６０ １.００ １００.００
Ｃｒｕｄｅ ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ
硫酸铵沉淀后酶液 １０ ４９０ ３９.７２ １.２１ ３７.１２
Ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅｄ ｂｙ ａｍｍｏｎｉｕｍ ｓｕｌｆａｔｅ
ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２ 处理后酶液 ６ ２４８ １.４２ １３.７０ ９.３９
Ｅｎｚｙｍｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２

明是纯酶蛋白ꎮ 根据 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 中各标准蛋白条
带的相对迁移率ꎬ得到蛋白质分子质量标准曲线

和相对迁移率的回归方程:ｙ ＝ ５.０９０ ９ － ０.９５６ ６ｘ
(Ｒ ＝ ０.９９３ ９)ꎮ 经计算得到人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水
２
解酶的分子量约为 ６５.６ ｋｕꎮ
利用其提纯的糖基水解酶与 ０.１％的人参皂苷
Ｒｂ３ 反应ꎬ其反应产物用 ＨＰＬＣ 测定结果ꎬ如图 ４
所示ꎮ 图 ４ 结果表明ꎬ人参皂苷 Ｒｂ３ 在人参皂苷

Ｒｂ３ 糖基水解酶的催化作用下ꎬ产物主要是 Ｒｄ、Ｆ２
和 Ｃ－Ｋꎬ其中 Ｒｄ 含量最多ꎬ其次是 Ｆ２ꎬＣ￣Ｋ 相对

较少ꎮ
２.３ 酶促反应动力学
将不同浓度的 Ｒｂ３ 底物溶液与等体积纯酶液
混合ꎬ最终浓度分别为７.１５、８.３５、１０.０、１２.５、１６.５、
￣１
２５.０ ｍｍｏｌＬ 的 Ｒｂ３ 底物溶液ꎬ于 ４５ ℃ 反应 ５、
１０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０ ｍｉｎ 后ꎬ对其 Ｒｂ３ ６ 种
浓度、８ 种不同反应 时 间 段 的 Ｒｂ３ 反 应 产 物ꎬ作

ＴＬＣ 检测ꎬ如图 ５ 所示ꎮ
由图 ５ 可知ꎬ人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶的催

化反应随时间的延长ꎬＲｂ３ 的降解量在不断提高ꎬ
图 ３ 经纯化后提纯酶的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ
Ｆｉｇ. ３ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｅｎｚｙｍｅ ｉｎ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 在 ５ ~ １０ ｍｉｎ Ｒｂ３ 的降解量较低ꎬ２０ ｍｉｎ 后 Ｒｂ３ 的
降解量明显提高ꎮ 利用软件分析图 ４ 中 Ｒｂ３ 皂苷
斑点的降解量ꎬ取催化反应 ５、１０、２０、６０、９０ ｍｉｎ 时
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳法检测ꎬ结果如图 ３ 所示ꎮ
经硫酸铵沉淀以及 ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２ 分离 Ｒｂ３ 降解量ꎬ计算 Ｖ ｍａｘ ꎮ 在 ５ ｍｉｎ 时计算得到 Ｋ ＝
ｍ
￣１
￣１
￣１
纯化的结果见表 １ꎮ 从表 １ 可以看出ꎬ纯化后酶蛋 ２.９４ ｍｍｏｌＬ ꎬＶ ｍａｘ ＝ ２０.２１ ｍｍｏｌＬ ｈ ꎻ在 １０
￣１
￣１ ｍｉｎ 时计算得到 Ｋ ＝ ５.３２ ｍｍｏｌＬ ꎬＶ ＝ ２８.７３
白的含量为 ０.２３７ ｍｇｍＬ ꎬ蛋白比活力为 １６９ ｍ ｍａｘ
￣１ ￣１
￣１
Ｕｍｇ ꎬ纯化倍数为 １３.７０ꎬ回收率为 ９.３９％ꎮ ｍｍｏｌＬ ｈ ꎻ在 ２０ ｍｉｎ 时计算得到 Ｋ ＝ ８.７７
ｍ
￣１
￣１
￣１
ｍｍｏｌＬ ꎬＶ ＝ ５７.４４ ｍｍｏｌＬ ｈ ꎻ 在 ６０ ｍｉｎ
由图 ３ 可知ꎬ提纯分离的 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ ｍａｘ
￣１
菌的第 ９３、９４ 管洗脱液ꎬ产生了电泳单一条带ꎬ证 时计算得到 Ｋ ＝ ８.９３ ｍｍｏｌＬ ꎬＶ ｍａｘ ＝ ６６.６３ ｍｍｏｌ
ｍ