Page 113 - 《广西植物》2020年第5期

５ 期 张睿哲等: 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶的纯化及其反应特性 ７ ０ ９

ＴＬＣ 版皂苷斑点中 Ｒｂ３ 的降解量ꎬ确定 Ｒｂ３ 各底
物浓度在 ５、１０、２０、４０、６０ ｍｉｎ 时的 Ｒｂ３ 酶反应初
速 度 ( 平 均 值 )ꎮ 根 据 酶 反 应 初 速 度ꎬ 作
Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ￣Ｂｕｒｋ 曲 线 ( 齐 崴 等ꎬ ２００１ꎻ 张 华 新 等ꎬ

２００６ꎻ陈娇娇等ꎬ２０１１ꎻ史刘辉等ꎬ２０１２):
１ Ｋ ｍ １ １
＝ × ＋ ꎮ
Ｖ Ｖ Ｓ Ｖ
ｍａｘ ｍａｘ
通过所得到的直线方程可以得到横轴的截距
－１ / Ｋ ꎬ纵轴的截距 １ / Ｖ ꎬ即可计算出 Ｋ 和 Ｖ
ｍ ｍａｘ ｍ ｍａｘ
值ꎬ将结果代入得 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ￣Ｍｅｎｔｅｎ 方程ꎮ 这为酶
反应工程设计提供依据ꎮ
１.２.９ 以 ｐＮＰ 为底物的酶活性测定 以对硝基苯

酚 单 糖 苷 ( ｐＮＰ￣α￣Ｄ￣Ｇａｌ、 ｐＮＰ￣β￣Ｌ￣Ａｒａ、 ｐＮＰ￣α￣Ｌ￣
Ｒｈａ、ｐＮＰ￣β￣Ｄ￣Ｘｙｌ、ｐＮＰ￣β￣Ｄ￣Ｇｌｕ)为底物ꎬ含有 ４００
μＬ 的 ０.０８ ｍｍｏｌＬ 的 ｐＮＰ 底物溶液ꎬ与酶样品
￣１
１００ μＬ 混 合ꎬ４５ ℃ 反 应 ３０ ｍｉｎ 后 加 入 ５ ｍＬ １
ｍｏｌＬ Ｎａ ＣＯ 终止反应ꎬ测定 ４０５ ｎｍ 下的吸光
￣１
２ ３
值ꎮ 酶活力定义为单位时间内释放 １ μｍｏｌ 硝基苯
酚的酶量为一个酶活力单位ꎮ

２ 结果与分析

２.１ 粗酶液的制备 Ｒｂ３ꎬ Ｒｄꎬ Ｒｂ１ꎬ Ｆ２ꎬ Ｃ￣Ｋ. 人参皂苷标准品ꎻ １－１０. ｐＨ 值ꎻ
１０－２４. 反应时间ꎮ
由 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌接种得到的粗酶液ꎬ
Ｒｂ３ꎬ Ｒｄꎬ Ｒｂ１ꎬ Ｆ２ꎬ Ｃ￣Ｋ. Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ ｓｔａｎｄａｒｄꎻ １－
在 Ｒｂ３ 浓 度 ０. ０１％ ~ ０. ５％ 范 围 内ꎬ 均 能 转 化 为 １０. Ｖａｌｕｅ ｏｆ ｐＨꎻ １０－２４. Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ.
Ｒｄ、Ｆ２ 和 Ｃ￣Ｋꎮ 最佳反应温度为 ４５ ℃ ꎬ最佳反应
图 １ ｐＨ 和时间对人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基
时间 ２ ｈꎬｐＨ 值在 １.３ 至 ６.０ 的状态下反应效果较 水解酶粗酶液反应的影响
Ｆｉｇ. １ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｐＨ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｏｎ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ
好ꎬ酶反应最佳 ｐＨ 为 ３.０ ~ ５.０ꎬ而在 ｐＨ４.０ ~ ６.０
Ｒｂ３￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｒｅａｃｔｉｏｎ
范围内相对稳定ꎬ其中在 ｐＨ５.０ 的偏酸性环境下
稳定性最高ꎬ如图 １ 和图 ２ 所示ꎮ
经三次实验结果表明ꎬＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌

产酶 活 力ꎬ 在 相 同 条 件 下 比 文 献 中 的 Ａｂｓｉｄｉａ
ｓｐ. ＧＲＢ３￣Ｘ８ｒ 菌产酶活力ꎬ提高了 １５％ ~ ２５％ꎮ
２.２ 酶的分离纯化
将上述粗酶液经 ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２ 离子交
换柱洗脱ꎬ收集的第 ８１、９３、９４、９５ 试管ꎬ具有将人
参皂苷 Ｒｂ３ 水解生成人参皂苷 Ｒｄ、Ｆ２ 和 Ｃ￣Ｋ 的高
酶活力ꎮ 因此对第 ８１、９３、９４、９５ 管的 酶 液 进 行 图 ２ 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶 ｐＨ 值稳定性

ＰＡＧＥ 电泳ꎬ 结果第 ９３、９４ 管酶基本为电泳单带ꎻ Ｆｉｇ. ２ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄ
将上述电泳单带的酶蛋白切胶回收ꎬ 进一步采用 ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ Ｒｂ３￣ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ