Page 112 - 《广西植物》2020年第5期
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７ ０ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
展中心产品ꎻ以上试剂均为分析纯试剂ꎮ 梯度ꎻ进样量:１０ μＬꎻ柱温:３５ ℃ ꎻ体积流速:０.６
薄层层析板 Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ ６０￣Ｆ２５４ꎬ德国 Ｍｅｒｃｋ 公 ｍＬｍｉｎ ꎻ检测波长:２０３ ｎｍꎮ
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司产 品ꎻ ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ￣５２ꎬ 英 国 Ｗｈａｔｍａｎ 公 １.２.５ 酶的分离纯化 先向 ＤＥＡＥ￣ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ＤＥ５２
司产品ꎻＣＳ９３０ 双波长薄层扫描仪购置于日本津岛 阴离子交换柱中缓慢上样 ６ ｍＬ 粗酶液ꎬ进行分离
公司ꎻＢＳＺ￣１６０ 自动部分收集器由上海金生达生化 提纯ꎮ 再配制由 ２０ ｍｍｏｌＬ ｐＨ３.０ 的磷酸氢二
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仪器有限公司提供ꎻ蛋白质电泳仪购置于 Ｂｉｏ￣Ｒａｄ 钠－柠檬酸缓冲体系溶液溶解的浓度为 ４０、５０、６０、
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公司ꎻＷａｔｅｒｓ ２６９５ 高效 液 相 色 谱 仪ꎻＷａｔｅｒｓ ２９９６ ７０、８０、９０、１００ ｍｍｏｌＬ 的 ＫＣｌ 溶液ꎬ对上样后的
ＰＤＡ 光电二极管阵列检测器ꎻＫｎａｕｅｒ Ｃ１８ 色谱柱 粗酶液进行梯度洗脱ꎬ每一梯度洗 １００ ｍＬꎬ控制流
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(５ μｍꎬ３ ｍｍ × ２５０ ｍｍ)ꎮ 速为 １ ｍＬｍｉｎ ꎬ用自动部分收集器ꎬ大约每 ３
１.２ 方法 ｍＬ 收集 １ 试管洗脱液ꎻ收集酶液与 ０.１％ Ｒｂ３ 反
１.２.１ 粗酶液的制备 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌接种 应ꎬＴＬＣ 检测ꎬ筛选出含有 Ｒｂ３ 糖基水解酶活力的
于含 ５％的麦汁、１％ 的三七茎叶浸出液ꎬｐＨ ＝ ６.６ 洗脱液ꎮ
的察氏培养基中ꎬ在 ３０ ℃ 摇床培养 ５ ~ ６ ｄꎻ离心除 １.２.６ 蛋白质分子量的测定 将含有酶活力的洗
菌体ꎬ上清液中缓慢加入已研磨好的硫酸铵粉末 脱液ꎬ做 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳ꎬ确定产生单一条带的试
至 ８０ ％饱和度ꎬ摇匀ꎬ于 ４ ℃ 下静置 ６ ｈꎻ离心收集 管ꎬ同时计算人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶的分子量
￣１ (李建武ꎬ１９９７)ꎮ ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶的浓缩胶
蛋白质沉淀ꎮ 将沉淀溶于 少 量 的 ０. ０１ ｍｏｌ Ｌ
ｐＨ ＝ ３.０ 磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液ꎬ透析ꎬ每 ２ ｈ 和分离胶分别为 ５％和 １２％ꎬ电压分别为 ６０ Ｖ 和
更换一次缓冲液ꎬ透析 ２０ ｈꎻ离心除杂ꎬ沉淀溶于 １２０ Ｖꎮ
０.０２ ｍｏｌＬ ｐＨ３.０ 磷酸氢二钠 －柠檬酸缓冲液 １.２.７ 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶最佳反应条件
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中ꎬ即为粗酶液ꎮ 测定最佳 ｐＨ:分别配制 ｐＨ 值为 １.３、２.２、３、４、５、
１.２.２ 酶活力的测定 取 ０.１ ｍＬ 的 ０.２％的人参皂 ６、７、８、９、１０ 的缓冲溶液ꎬ将 ０.１％的人参皂苷 Ｒｂ３
苷 Ｒｂ３(０.０２ ｍｏｌＬ ꎬｐＨ３.０ 磷酸氢二钠－柠檬酸 溶于不同 ｐＨ 值的缓冲溶液中ꎬ每个 ｐＨ 值底物溶
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缓冲液)与 ０.１ ｍＬ 粗酶液混合ꎬ在 ４５ ℃ 条件下反 液与同 ｐＨ 值的酶液等体积均匀混合ꎬ在适宜的条
应 ２４ ｈꎬ加入 ０.２ ｍＬ 水饱和正丁醇终止酶反应ꎬ取 件下做酶促反应ꎬ用 ＴＬＣ 法检测人参皂苷 Ｒｂ３ 的
上层有机相作 ＴＬＣ 薄层层析或 ＨＰＬＣ 检测ꎮ 酶活 水解情况ꎮ 确定 ｐＨ 稳定性:取纯化酶液与不同
力单位ꎬ定义为每小时降解 １ ｍｍｏｌ Ｒｂ３ 酶量为一 ｐＨ 值的缓冲液等量混合ꎬ室温下放置 ３０ ｍｉｎꎬ加
个酶活力单位ꎮ 入人参皂苷 Ｒｂ３ 底物溶液ꎬ于酶的最适 ｐＨ 值反应
１.２.３ 薄层层析( ＴＬＣ) 酶水解人参皂苷 Ｒｂ３ 生 体系中检测酶活力ꎬ以未经处理过的酶活力作为
成产物用 ＴＬＣ 方法测定ꎮ 展开剂为 Ｖ( 氯仿) ∶ １００％计算相对酶活力ꎮ 确定最佳反应温度:在上
Ｖ(甲醇) ∶ Ｖ(水)的比例为 ７ ∶ ３ ∶ ０.５ꎬ展开后用 述反应条件下ꎬ采用 ３５、４０、４５、５０、５５℃ 条件下进
１０％ Ｈ ＳＯ 水溶液ꎬ于 １０５ ℃ 加热显色ꎮ ＴＬＣ 检测 行酶催化反应ꎮ 确定最佳反应时间:在最佳反应
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图中的各组分的百分含量ꎬ利用 Ｂａｎｄｓｃａｎ 分析软 温度下ꎬ 将 酶 液 与 底 物 溶 液 分 别 反 应 １ / ６、１ / ３、
件分析(Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ １ / ２、１、２、４、８、１２、２４ ｈꎬ用 ＴＬＣ 法检测人参皂苷
１.２.４ 高效液相色谱(ＨＰＬＣ) 色谱条件:色谱仪ꎬ Ｒｂ３ 的水解情况ꎮ
Ｗａｔｅｒｓ ２６９５ 高 效 液 相 色 谱 分 析 仪ꎬ Ｗａｔｅｒｓ ２９９６ １.２.８ 酶反应动力学 配制浓度分别为 １４.３、１６.７、
ＰＤＡ 光电二极管阵列检测器及 Ｅｍｐｏｗｅｒ 色谱工作 ２０.０、２５.０、３３.０、５０.０ ｍｍｏｌＬ 的 Ｒｂ３ 底物溶液
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站进行检测ꎮ 色谱柱:Ｋｎａｕｅｒ Ｃ１８ 柱ꎻ流动相:乙 与等 体 积 纯 酶 液 混 合ꎬ 最 终 浓 度 分 别 为 ７. １５、
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腈( Ａ) － 水 ( Ｂ)ꎻ０ ~ ２０ ｍｉｎꎬ２０％ Ａ 等 度ꎻ２０ ~ ３１ ８.３５、１０.０、１２.５、１６.５、２５.０ ｍｍｏｌＬ 的 Ｒｂ３ 底物
ｍｉｎꎬ２０％Ａ~ ３２％Ａ 线性梯度ꎻ３１ ~ ４０ ｍｉｎꎬ３２％Ａ ~ 溶液ꎻ于 ４５ ℃ 反应 ５、１０、２０、４０、６０、９０、１２０、１８０
４３％Ａ 线性梯度ꎻ４０ ~ ７０ ｍｉｎꎬ４３％Ａ ~ １００％Ａ 线性 ｍｉｎ 后ꎬ对 Ｒｂ３ 反 应 产 物 做 ＴＬＣ 检 测ꎬ利 用 分 析
