Page 117 - 《广西植物》2020年第5期

５ 期 张睿哲等: 人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶的纯化及其反应特性 ７ １ ３

￣１
￣１
￣１
ｍｍｏｌＬ ｈ ꎬ即 Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ￣Ｍｅｎｔｅｎ 方程: 应ꎬ反应米氏常数 Ｋ 值为 ８.７７ ｍｍｏｌＬ ꎬＶ 为
ｍ ｍａｘ
６６.６３Ｓ ５７.４４ ｍｍｏｌＬ ｈ ꎻ在 ６０ ｍｉｎ 时反应速度达到
￣１
￣１
Ｖ ＝ ꎮ
８.９３＋Ｓ 最大ꎬＶ 趋于稳定ꎬ为 ６６.６３ ｍｍｏｌＬ ｈ ꎮ 上
￣１
￣１
ｍａｘ
从上述数据可以得出ꎬ人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水 述研究成果ꎬ为酶转化三七茎叶皂苷制备稀有人
解酶的酶反应速度遵循米氏方程的规律ꎬ底物浓
参皂苷提供了理论基础ꎮ
度较低时ꎬ先遵循一级反应ꎬ反应速度随底物浓度
该酶先水解人参皂苷 Ｒｂ３ 的 ２０￣Ｏ￣木糖基变
上升而上升ꎬ然后在 ２０ ｍｉｎ 时进入混合级反应ꎬ最
为人参皂苷 Ｒｄꎬ进一步水解人参皂苷 Ｒｄ 的 ３￣Ｏ￣
后在 ６０ ｍｉｎ 时反应速度达到最大ꎬ反应速度不再
葡萄糖基变为人参皂苷 Ｆ２ꎬ再进一步水解人参皂
随浓度上升而上升ꎬ进入零级反应ꎬ此时 Ｖ 趋于
ｍａｘ 苷 Ｆ２ 的 ３￣Ｏ￣葡萄糖基变为最终产物 Ｃ￣Ｋꎮ 对于葡
稳定ꎮ
萄糖 苷 酶 对 多 种 糖 基 具 有 水 解 作 用 的 研 究ꎬ
从图 ４ 和图 ５ 可以看到ꎬＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌
Ｌａｒｓｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ.(２０１４) 在研究 Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｏｖａｔｕｓ 中
所产的人参皂苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶ꎬ水解人参皂苷
木葡聚 糖 分 解 代 谢 相 关 的 酶 基 因 时 发 现ꎬ 其 中
Ｒｂ３ 的产物主要有 Ｒｄ、Ｆ２ 和 Ｃ￣Ｋꎮ 该酶先水解人
ＢｏＧＨ３１Ａ 在切 除 α ( １ → ６)￣木 糖 基 后 允 许 水 解
参皂苷 Ｒｂ３ 的 ２０￣Ｏ￣木糖基变为 Ｒｄꎬ进一步水解
β￣葡萄糖基和 β￣半乳糖基ꎻＯｐａｓｓｉｒｉ ｅｔ ａｌ.(２００４)从
人参皂苷 Ｒｄ 的 ３￣Ｏ￣葡萄糖基变为 Ｆ２ꎬ再进一步水
水稻(Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ)中克隆得到 ｂｇｌｕ１ 基因ꎬ其表达
解人参皂苷 Ｆ２ 的 ３￣Ｏ￣葡萄糖基变为最终产物 Ｃ￣
产物 β￣葡萄糖苷酶不仅能水解一些天然的葡萄糖
Ｋꎮ 也就是说ꎬＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌所产的人参皂
苷ꎬ也能水解对硝基苯基 β￣岩藻糖苷、β￣半乳糖苷
苷 Ｒｂ３ 糖基水解酶具有水解木糖基和葡萄糖基的
和 β￣木糖苷ꎬ另外他 们 也 克 隆 得 到 ｏｓ４ｂｇｌｕ１２ 基
特异性ꎮ 其酶反应途径如图 ６ 所示ꎮ
因ꎬ其表达产物同样也具有水解多种糖基的特性ꎬ
２.４ 以 ｐＮＰ 单糖苷为底物酶催化特性
对 β￣葡萄糖苷、β￣半乳糖苷、β￣甘露糖苷、β￣木糖
用纯化后的第 ９３、９４ 管酶液ꎬ采用 １. ２. ９ 方
苷和 ａ￣阿拉伯糖苷都有水解作用( Ｏｐａｓｓｉｒｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ
法ꎬ进行酶活力测定ꎬ结果如表 ３ 所示ꎮ 表中数据
２００６)ꎻＴｓｕｋａｄａ ｅｔ ａｌ.(２００６) 从 Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ ｃｈｒｙ￣
表明ꎬ该酶不仅能水解 β￣Ｄ￣木糖苷ꎬ还能水解 β￣Ｄ￣
ｓｏｓｐｏｒｉｕｍ 中克隆 了 糖 基 水 解 酶 家 族 １ 中 的 两 个
葡萄糖苷ꎬ对 α￣Ｄ￣半乳糖苷、α￣Ｌ￣鼠李糖苷、β￣Ｌ￣阿
β￣葡萄糖苷酶 ＢＧＬ１Ａ 和 ＢＧＬ１Ｂꎬ其中 ＢＧＬ１Ｂ 对
拉伯糖苷无水解能力ꎬ表现出独特的水解特性ꎮ
β￣葡萄糖苷和 β￣半乳糖苷都有降解作用ꎮ 上述研
究中发现的 β￣葡萄糖酶都归属为酶学数据库内
３ 讨论与结论 ＥＣ.３.２.１.２１ 酶类ꎬ都属于 ＧＨ１ 家族ꎬ且该家族中
能水解多种糖基的糖苷酶种类也较多ꎮ 本文中
本文的 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌产人参皂苷 Ｒｂ３
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌所产人参皂苷糖基水解酶也
糖基 水 解 酶 活 力ꎬ 在 相 同 条 件 下 比 文 献 中 的
具有水解人参皂苷 Ｒｂ３ 木糖基和葡萄糖基的特
Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ. ＧＲＢ３￣Ｘ８ｒ 菌产酶活力高 １５％ ~ ２５％ꎻ本
性ꎬ认为此糖苷酶应归属于 ＧＨ１ 家族ꎮ
文 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｓｐ. Ｐ９０ｒ 菌所产酶蛋白的比活力为
１６９ Ｕｍｇ ꎬ对人参皂苷 Ｒｂ３ 的糖基具有较好的
￣１
参考文献:
水解活力ꎻＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳测得分子量约为 ６５.６
ｋｕꎬ接近于 Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ. ＧＲＢ３￣Ｘ８ｒ 菌酶分子量 ６６.７
ＣＨＥＮ ＪＪꎬ ＳＵＮ Ｊꎬ ＪＩＮ ＦＸꎬ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１. Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｋｕꎮ 该酶在 ｐＨ５.０ 的偏酸性环境下酶活力很高ꎬ ｇｉｎｓｅｎｏｓｉｄｅ￣ｇｌｙｏｓｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ Ａｂｓｉｄｉａ ｓｐ. Ｇ８ｒ [Ｊ]. Ｊ Ｄａｌｉａｎ
在接近中性环境以及碱性环境下酶活力迅速下 Ｐｏｌｙｔｅｃｈ Ｕｎｉｖꎬ ３０(１): １３－１７. [陈娇娇ꎬ 孙键ꎬ 金凤燮ꎬ
等ꎬ ２０１１. Ｇ８ｒ 菌产人参皂苷糖苷酶的酶性质及酶水解作
降ꎬ在 ｐＨ 值 ８.０ 及以上完全没有酶活性ꎮ 最适反
用 [Ｊ]. 大连工业大学学报ꎬ ３０(１):１３－１７.]
应条件是 ｐＨ ＝ ３.０ ~ ５.０、４５ ℃ ꎬ在 ｐＨ ＝ ４.０ ~ ６.０ 范
ＨＡＮ ＳＸꎬ ＹＯＵ Ｙꎬ ２０１６. Ｂａｌａｎｃｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ ｐｈａｒ￣
围内相对稳定ꎮ 该酶在 ２０ ｍｉｎ 时进入混合级反 ｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｓａｐｏｎｉｎｓ ｏｆ Ｐａｎａｘ ｎｏｔｏ￣