Page 88 - 《广西植物》2023年第10期
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１ ８ ４ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
３７ ℃ 水浴 ３０ ｍｉｎꎻ转移至培养皿中ꎬ加入 ０.５ ｍＬ
Ｇａｌｂｒａｉｔｈ 解离液以及 ０.５ ｍＬ ＷＰＢ 解离液ꎬ使用刀
片快速切碎并置于室温孵化 １５ ｍｉｎꎻ通过尼龙膜
￣１
过滤ꎬ进行 ５００ ｒｍｉｎ 低速离心 ５ ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ
再进行 ２ ０００ ｒｍｉｎ 高速离心 ５ ｍｉｎꎬ弃去上清
￣１
液ꎬ加入 ０.５ ｍＬ ＷＰＢ 解离液对细胞核进行重悬ꎻ
使用含 ＲＮａｓｅ Ａ 的碘化丙啶(ＰＩ) 染液对细胞核进
行避光染 色 １５ ｍｉｎꎮ 每 个 样 品 设 置 ３ 次 生 物 学
重复ꎮ 虚线纵坐标对应 Ｋ￣ｍｅｒ 种类频率ꎬ实线纵坐标对应 Ｋ￣ｍｅｒ
１.３.４ 流式细胞仪检测和分析 使用流式细胞仪 数量频率ꎮ
Ｏｒｄｉｎａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｄｏｔｔｅｄ ｌｉｎｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ Ｋ￣ｍｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ
检测被染色的细胞核的荧光强度ꎮ 上机前使用滤
ｆｒｅｑｕｅｎｃｙꎬ ａｎｄ ｏｒｄｉｎａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｓ ｔｏ Ｋ￣ｍｅｒ
膜再次过滤ꎬ并使用 Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ 软件的 ＦＬ￣２ 荧光通 ｎｕｍｂｅｒ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ.
道获取荧光强度ꎮ 上机时先调整电压强度ꎬ使得 图 １ 海三棱藨草样本 ＣＪ１ 的 １７￣ｍｅｒ 分布曲线
待测样品的 Ｇ０ / Ｇ１ 峰均值在 ５０ ~ １００ 之间ꎬ调整 Ｆｉｇ. １ １７￣ｍｅｒ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅ ｏｆ
后保持参数不变ꎬ收集最少 １０ ０００ 个细胞ꎬ每个样 Ｓｃｉｒｐｕｓ ｍａｒｉｑｕｅｔｅｒ ｓａｍｐｌｅ ＣＪ１
品进行 ３ 次技术重复ꎮ
使用 ＭｏｄＦｉｔ 软件对收集的数据进行分析ꎬ生 进行统计ꎬ 结果见表 ２ꎬ得到的 Ｃｏｎｔｉｇ Ｎ５０ 为 ９ ０９６
成各样品荧光分布直方图ꎬ根据公式[ 待测植物的 ｂｐꎬ 总 长 为 １８８ ３６４ ８７７ ｂｐꎬ 将 Ｃｏｎｔｉｇ 组 装 成
基因组大小 １Ｃ 值(ｐｇ 或 Ｍｂｐ) ＝ 参考样品的基因 Ｓｃａｆｆｏｌｄ Ｎ５０ 为 １７ ２８７ ｂｐꎬ总长为 １８９ ８１９ ２１９ ｂｐ
组大小 １Ｃ 值 × 目标样品 Ｇ０ / Ｇ１ 峰荧光均值 / 参 (表 ２)ꎮ
照样品 Ｇ０ / Ｇ１ 峰荧光均值] 计算 １Ｃ 值( Ｄｏｌｅｚｅｌ ｅｔ 统计基因组 Ｃｏｎｔｉｇ 分布和 ＧＣ 含量信息ꎬ结果
ａｌ.ꎬ ２００７)ꎬ比较相同物种各样本 Ｇ０ / Ｇ１ 峰荧光均 见图 ２ꎮ 海三棱藨草样本 ＣＪ１ 的 Ｃｏｎｔｉｇ 分布在 ７９
值比例以确定物种内是否存在多种倍性ꎮ 左右有最高峰( 图 ２:Ａꎬ Ｃ)ꎬ基因 组 ＧＣ 含 量 为
使用 ＳＰＳＳ 软件对数据进行统计分析ꎬ使用单 ３７.２５％ꎬＧＣ 含量的深度信息显示 ＧＣ 图存在分离
现象(图 ２:ＢꎬＤꎬＥ)ꎬＣｏｎｔｉｇ 和 ＮＣＢＩ 核酸库比对条
因素方差分析比较藨草属植物基因组大小ꎬＦｉｓｈｅｒ
ＬＳＤ 多重比较法(Ｐ<０.０５ꎬｎ ＝ ３) 对藨草属植物基 数最多的物种均为植物ꎬ而非微生物或昆虫ꎬ表明
因组大小进行物种间两两比较ꎮ 没有受到外源污染或污染程度低ꎬ可以忽略ꎮ
２.２ 流式细胞仪测定藨草属植物 ＤＮＡ Ｃ 值
２ 结果与分析 以绿豆为内标测定其他藨草属植物( 共 １３ 个
样本)基因组大小的流式细胞分析图见图 ３ꎬ换算
２.１ 海三棱藨草样本 ＣＪ１ 基因组 Ｓｕｒｖｅｙ 分析 出各样本的 ＤＮＡ Ｃ 值见表 ３ꎬ为了与基因组 Ｓｕｒｖｅｙ
２.１.１ 基因组数据统计和特征 我们对海三棱藨 分析所测基因组大小比较ꎬ流式细胞术所测 １Ｃ 值
草样本 ＣＪ１ 的基因组原始数据进行过滤处理ꎬ并 统一 换 算 为 Ｍｂｐ 单 位ꎮ 由 表 ３ 可 知ꎬ 标 准 品 的
获得了高质量数据共 ３１.１７ Ｇꎮ 我们采用 Ｋ￣ｍｅｒ ＝ ＤＮＡ 峰平均变异系数( ＣＶ) 值大部分在 ５％以下ꎬ
少数在 ６％左右ꎬ待测样品的 ＤＮＡ 峰平均 ＣＶ 值在
１７ 进行分析ꎬ频率分布图见图 １ꎬ在横坐标 Ｋ￣ｍｅｒ
５.３１％ ~ ６. ９７％ 之 间ꎮ 各 藨 草 属 植 物 １Ｃ 值 在
深度 １０２ 有一个纯合峰ꎬ即 Ｋ￣ｍｅｒ 期望深度为 １０２
(图 １)ꎮ Ｋ￣ｍｅｒ 总数约 ２３.６６ Ｇꎬ由公式计算得到 ２３４.８７ ~ ５３７. ３３ Ｍｂｐ 之 间: 海 三 棱 藨 草 １Ｃ 值 在
２３４.８７ ~ ２４２. ５０ Ｍｂｐ 之 间ꎬ 扁 秆 藨 草 １Ｃ 值 在
海三棱藨草样本 ＣＪ１ 基因组大小(１Ｃ) 为 ２４９.０７
Ｍｂｐꎬ修正后为 ２４４.１２ Ｍｂｐꎬ杂合率为 ０.６８％ꎬ重复 ２５１.７７ ~ ２６４.１３ Ｍｂｐ 之间ꎬ海三棱藨草和扁秆藨草
序列比例为 ４２.３８％ꎮ 的杂交材料 １Ｃ 值在 ２５４.０８ ~ ２６３.４４ Ｍｂｐꎮ 其中ꎬ
２.１.２ 基因组初步组装结果 采用 Ｋ￣ｍｅｒ ＝ ４１ 对 最大的是藨草样本 ＳＴ１ [ １Ｃ ＝ ( ５３７. ３３ ± ２２. ７５)
海三棱藨草样本 ＣＪ１ 的测序数据进行基因组初步 Ｍｂｐ]ꎬ最 小 的 是 海 三 棱 藨 草 样 本 ＨＺ１ [ １Ｃ ＝
组装ꎬ对大于 １００ ｂｐ 的 Ｓｃａｆｆｏｌｄ 及其内部的 Ｃｏｎｔｉｇ (２３４.８７ ± ４.５３) Ｍｂｐ](图 ３ꎬ表 ３)ꎮ
