Page 164 - 《广西植物》2023年第9期

１ ７ １ ２ 广 西 植 物 ４３ 卷
单分子实时测序技术进行枫香叶片变色期全长转 １.４ 转录组完整性评估和结构分析
录组测序ꎬ获取高质量全长转录本进行分析和功能 使用 ＣＤ￣ＨＩＴ( Ｃｌｕｓｔｅｒ Ｄａｔａｂａｓｅ ａｔ Ｈｉｇｈ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
注释ꎬ旨在为后续研究枫香叶片变色分子机制、色 ｗｉｔｈ Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ)软件去除转录本中的冗余序列ꎬ获
素代谢合成途径和调控、相关功能基因的克隆以及 得非冗余转录本序列ꎻ利用 ＢＵＳＣＯ( Ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ
叶色改良提供遗传基础ꎮ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｓｉｎｇｌｅ￣Ｃｏｐｙ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｓ)对去冗余后的转录
本进行完整性评估ꎻ使用 ＴｒａｎｓＤｅｃｏｄｅｒ 软件进行转
１ 材料与方法 录本编 码 区 序 列 及 对 应 氨 基 酸 序 列 预 测ꎻ 利 用

ＣＰＣ ( Ｃｏｄｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ ) 分 析、 ＣＮＣＩ
１.１ 实验材料 ( Ｃｏｄｉｎｇ￣Ｎｏｎ￣Ｃｏｄｉｎｇ Ｉｎｄｅｘ ) 分 析、 Ｐｆａｍ ( Ｐｒｏｔｅｉｎ
枫香叶片变色期材料采自广西壮族自治区百 Ｆａｍｉｌｉｅｓ)蛋白结构域分析、ＣＰＡＴ( Ｃｏｄｉｎｇ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ Ｔｏｏｌ)分析 ４ 种方法预测 ｌｎｃＲＮＡꎻ筛选
色市德保县红叶森林公园(２３°２１′１９″ Ｅ、１０６°３９′５″
Ｎ)ꎬ采用平均木法ꎬ选取 ５ 株生长健壮的枫香植 ５００ ｂｐ 以 上 的 转 录 本ꎬ利 用 ＭＩＳＡ ( ＭＩｃｒｏＳＡｔｅｌｌｉｔｅ
株ꎮ 在每株枫香树上选取东、南、西、北 ４ 个方向 ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｔｏｏｌ ) 软 件 做 ＳＳＲ ( ｓｉｍｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｒｅｐｅａｔ)分析ꎮ
的枝条做好标记ꎬ自 ２０１８ 年 ９ 月底开始ꎬ每 １５ ~
１.５ 转录本功能注释
２０ ｄ 采集样品 １ 次ꎬ每次采样时在每株枫香的每
使 用 ＢＬＡＳＴ ( Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ
个枝条上采集 ５ 片完整叶片进行混合ꎬ共采集了 ５
Ｔｏｏｌ)软件将得到的非冗余转录本序列与 ＮＲ(Ｎｏｎ￣
次样品ꎮ 各时期叶片颜色如图 １ 所示ꎮ
１.２ ＲＮＡ 提取和 ｃＤＮＡ 文库构建 Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ )、 Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ
(Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ )、 ＧＯ ( Ｇｅｎｅ
采用 Ｔｒｉｚｏｌ 试剂提取枫香各时期叶片样品的总
Ｏｎｔｏｌｏｇｙ)、 ＣＯＧ ( Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ
ＲＮＡ(ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ)ꎬ用 １.２％的琼脂糖凝胶电泳
Ｐｒｏｔｅｉｎｓ)、 ＫＯＧ ( Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ
检测 ＲＮＡ 降解和污染情况ꎮ 使用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ２０００
Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ)、 ｅｇｇＮＯＧ ( Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ
分光光度计测量 ＲＮＡ 的纯度、浓度和吸收峰ꎮ 进一
Ｇｅｎｅａｌｏｇｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ: Ｎｏｎ￣ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ
步用 Ａｌｉｇｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ 检测 ＲＮＡ 质量ꎮ ＲＮＡ
Ｄａｔａｂａｓｅ)、Ｐｆａｍ、ＫＥＧＧ (Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ
检测合格后ꎬ取各时期 ２８Ｓ / １８Ｓ>１ꎬ且 ＲＩＮ>６.５ 的
ａｎｄ Ｇｅｎｏｍｅｓ)数据库进行比对ꎬ获得转录本的注释
ＴＭ
ＲＮＡ 等 量 混 合ꎬ 使 用 ＳＭＡＲＴｅｒ ＰＣＲ ｃＤＮＡ
信 息 ( 邹 智 等ꎬ ２０２１ )ꎻ 利 用 ｉＴＡＫ ( Ｐｌａｎｔ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 合成 ｍＲＮＡ ( ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ) 的全长
Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ ＆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｋｉｎａｓｅ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒ ａｎｄ
ｃＤＮＡ( ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ)ꎬ通过 ＰＣＲ( ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
Ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ)软件鉴定转录因子ꎮ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ)扩增放大全长 ｃＤＮＡ 进行末端修复ꎬ
并连接 ＳＭＲＴ 哑铃型接头进行核酸外切酶消化ꎬ获 ２ 结果与分析
得一个 １~６ ｋｂ 的文库ꎮ 在 Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＲＳ ＩＩ
平台上进行 ＳＭＲＴ 测序(委托百迈客生物科技有限 ２.１ 枫香叶片变色期全长转录组文库构建
公司)ꎮ 使用 ２ 个 ＳＭＲＴ ｃｅｌｌ 进行全长转录组测序ꎬ获
１.３ 测序数据的质量控制和序列聚类 得 ４１. ０４ Ｇｂ 清洁数据ꎮ 从中提取到 ７３１ ８４９ 条
将原始序列中长度小于 ５０ ｂｐ 的片段和准确 ＣＣＳꎬ约 计 １ １７８ ４１６ ０９８ ｂｐꎮ ＣＣＳ 平 均 长 度 为
性小于 ０.９０ 的序列过滤ꎬ获取到过滤后的测序数 １ ６１０ ｂｐ( 图 ２:Ａ)ꎬ测序平均深度 为 ４６ × ( 图 ２:
据ꎮ 根据序列中的接头ꎬ将序列转换成环形一致 Ｂ)ꎮ 从 ７３１ ８４９ 条 ＣＣＳ 中鉴定出全长非嵌合序列
序列 ＣＣＳ(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎ￣ｓｅｎｓｕｓ)ꎬ再根据 ＣＣＳ 判断是 ＦＬＮＣ(ｆｕｌｌ ｌｅｎｇｔｈ ｒｅａｄｓ ｎｏｎ￣ｃｈｉｍｅｒｉｃ)５６３ １８０ 条ꎬ占
否有 ３′引物、５′引物以及 ＰｏｌｙＡꎬ将序列分成全长 比为 ７６. ９５％ꎬ 其 长 度 分 布 如 图 ２: Ｃ 所 示ꎮ 对
和非全长序列ꎮ 将来自同一转录本的全长序列聚 ＦＬＮＣ 进行聚类ꎬ获得 ５０ ７３６ 条一致序列ꎬ校正后ꎬ
类ꎬ相似的聚成一簇ꎬ每个簇得到一条一致序列ꎬ 共得到 ５０ ２８２ 条(９９.１１％)高质量一致序列ꎬ长度
校正后ꎬ获得用于后续分析的高质量序列( 丁玉梅 分布如图 ２:Ｄ 所示ꎮ 对获得的高质量一致序列去
等ꎬ２０２０)ꎮ 冗余ꎬ得到 ２７ ２６９ 条全长转录本ꎮ