Page 36 - 广西植物2024年1期
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３ ２                                    广  西  植  物                                         ４４ 卷
            南宁市金花茶公园(１０８°２１′４３″ Ｅ、 ２２°４９′３０″ Ｎ)ꎬ               １.４.２ 密码子中性绘图、ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ 及 ＰＲ２￣ｐｌｏｔ 绘图
            采集单株新鲜幼嫩的叶片ꎬ装进有硅胶的自封袋                                在中性绘图分析中ꎬ以 ＧＣ１２ 和 ＧＣ３ 做散点图ꎬ
            内低温保存ꎬ用于后续提取总 ＤＮＡꎬ标本保存在广                           研究密码子 ３ 个位置碱基之间的相关性ꎬ从而分
            西壮族自治区中国科学院广西植物研究所标本                               析突变压力和自然选择对于密码子偏好性的影响

            馆ꎬ标本凭证为 ＣＳＦ２０２０００３ꎮ                                (Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４)ꎮ ＧＣ１２ 为 ＧＣ１ 和 ＧＣ２ 的平均
            １.２ ＤＮＡ 提取和测序                                      值ꎮ 如果 ＧＣ１２ 和 ＧＣ３ 之间显著相关ꎬ即 Ｒ 越大
                                                                                                       ２
                 使用改良的 ＣＴＡＢ 法从越南小花金花茶干燥                        且趋于 １ 时ꎬＧＣ１２ 与 ＧＣ３ 的相关程度越高ꎬ表明
            的叶片中提取总 ＤＮＡꎬ叶绿体基因组测序服务由                            突变压力是密码子使用偏向的决定因素ꎻ相反ꎬ如

            北京格致博雅生物科技有限公司提供ꎮ 使用 Ｆａｓｔｐ                         果相关性不显著ꎬ则回归曲线斜率偏低甚至接近
            软件处理测序获得的原始数据ꎬ除去过多的 Ｎ 序                            于 零ꎬ 表 明 密 码 子 偏 好 性 由 自 然 选 择 主 导

            列、接头序列和过短序列ꎬ输出大小为 １ ００５.１８ Ｍｂ                      (Ｓｕｅｏｋａꎬ １９８８)ꎮ
            的 ｃｌｅａｎ ｄａｔａꎬ用于后续的叶绿体基因组组装( Ｇｕ                         ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ 绘图进一步分析了密码子偏好性受
            ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ                                     碱基组成对的影响ꎬ以 ＧＣ 为横坐标、有效密码子
                                                                                       ３
            １.３ 基因组组装注释和序列表征                                   数为 纵 坐 标 进 行 绘 制 散 点 图ꎬ 根 据 下 式 计 算:
                 使用 ｇｅｔＯｒｇａｎｅｌｌｅ ｖ１.７.６.１ 组装 ｃｌｅａｎ ｄａｔａꎬ参      ＥＮＣ ＝ ２＋ ＧＣ ＋２９ / [ ＧＣ ＋(１ －ＧＣ ) ] ( 杨祥燕
                                                                                      ２
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            考数据库为 ｅｍｂｐｌａｎｔ＿ｐｔ( 陆生植物叶绿体)ꎬ最大                     等ꎬ２０２１ꎻ辛雅萱等ꎬ２０２１)ꎮ 当密码子偏好性仅受
            扩充循环数为 ２０ꎬ调用 Ｓｐｅｄａｓ 的 Ｋ￣ｍｅｒ 值为 ２１、                 突变影响时ꎬ基因将沿着或接近标准曲线分布ꎬ而
            ４５、６５、８５、１０５、１２７ꎻ拼接完成后用 Ｂａｎｄａｇｅ 软件                 当基因落在标准曲线以下时则说明自然选择等因
            可视化(Ｊｉａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 使用叶绿体基因组在                  素是影响密码子偏好性的主要因素(Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙ ｅｔ
            线注释 网 站 ＣＰＧＡＶＡＳ２ ( ｈｔｔｐ: / / ４７. ９６. ２４９. １７２:     ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ
            １６０１９ / ａｎａｌｙｚｅｒ / ｈｏｍｅ)ꎬ 以 Ｃ. ｐａｒｖｉｐｅｔａｌａ ( ＮＣ ＿      奇偶偏好性分析(ｐａｒｉｔｙ ｒｕｌｅ ２ ｐｌｏｔꎬ ＰＲ２￣ｐｌｏｔ)
            ０６７０８９. １ ) 为 参 照 基 因 组 进 行 注 释ꎮ 使 用               用于计算各密码子第 ３ 位 Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ 的含量ꎬ通常
            ＧＢ２ｓｅｑｕｉｎ 检查序列分区是否存在颠倒并手动调                         用于估计突变压力和自然选择对密码子偏好性的
            整准 确 位 置ꎬ 得 到 完 整 的 注 释 结 果 ( Ｐａｓｃａｌ ＆             影响(Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 以 Ａ３ / ( Ａ３ ＋Ｔ３) 为 ｙ
            Ｓｔｅｐｈａｎꎬ ２０１８ꎻ Ｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ 最后使用在线           轴ꎬＧ３ / (Ｇ３ ＋Ｃ３) 为 ｘ 轴绘制 ＰＲ２￣ｐｌｏｔ 图ꎮ 中心
            网站 ＣＰＧｖｉｅｗ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. １ｋｍｐｇ. ｃｎ / ｃｐｇｖｉｅｗ / )  点(Ａ ＝ Ｔꎬ Ｇ ＝ Ｃ)意味着自然选择和突变压力之间
            绘制了叶绿体基因组圈图( Ｌｉｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎮ 注                  没有偏差ꎮ 如果基因均匀分布在中心点周围ꎬ则
            释完成的叶绿体基因组提交至 ＧｅｎＢａｎｋ 数据库ꎬ                         认为密码子偏好性可能完全是由突变压力造成
            登录号为 ＮＣ＿０６９３１０.１ꎬ相应的 ＳＲＡ、ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ 和              的ꎬ否则ꎬ密码子的使用可能受到自然选择和其他
            ＢｉｏＳａｍｐｌｅ 编号分别为 ＳＲＲ２０６４８３１７、ＰＲＪＮＡ８６１８７２            因素的影响(Ｘｉａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ
            和 ＳＡＭＮ２９９３０８４９ꎮ                                    １.５ 重复序列分析
            １.４ 密码子使用偏好性分析                                         使用在线网站 ＲＥＰｕｔｅｒ 对散在重复序列进行
            １.４.１ 密码子相关参数计算  在剔除重复基因、含                         计算ꎮ 参数设置:最大计算重复次数 ＝ ２００ꎻ 最小
            有终 止 密 码 子 和 长 度 小 于 ３００ ｂｐ 的 编 码 序 列              重复序列>３０ ｂｐꎻ重复序列相似度>９０％ꎻ汉明距
            (ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ＣＤＳ)后ꎬ选取 ５２ 条 ＣＤＳ 序列进            离( Ｈａｍｍｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ) ＝ ３ ( Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１)ꎮ
            行密码子分析ꎮ 使用 Ｃｏｄｏｎ Ｗ １.４.２ 软件对相对                     简单重复序列使用在线网站 ＭＩＳＡ 进行鉴定和统

            同 义 密 码 子 使 用 度 ( ｒｅｌａｔｉｖｅ ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｃｏｄｏｎ        计分析ꎮ 各重复单元( ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ) 对应的最少重复
            ｕｓａｇｅꎬＲＳＣＵ) 进行分析ꎮ 利用 ＥＭＢＯＳＳ 工具包中                   次数分别为 １ ~ １０、２ ~ ５、３ ~ ４、４ ~ ３、５ ~ ３、６ ~ ３ꎬ相

            的 ＣＵＳＰ 程序分析总 ＧＣ 含量以及第 １、第 ２ 和第 ３                   邻 ＳＳＲ 之间的最小单位间隔距离设置为 １００ ｂｐ
            个碱基位置( ＧＣ１、ＧＣ２、ＧＣ３) 的 ＧＣ 含量ꎬＣＨＩＰＳ                  (Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ
            程序用于分析有效密码子数( ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ                  １.６ 叶绿体基因组 ＩＲ 边界分析
            ｃｏｄｏｎｓꎬＥＮＣ) ( 朱伟垚等ꎬ２０２２)ꎮ 采用 Ｒ 软件中                     基于 系 统 发 育 分 析 的 结 果ꎬ 以 簇 蕊 金 花 茶
            的 ｃｏｒ()函数计算相关性ꎮ                                    (Ｃ. ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ)叶绿体基因组为参考ꎬ使用本地部
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