Page 79 - 《广西植物》2024年第10期

１０ 期 陈娇娇等: 镉积累对艾纳香内生菌群落结构和共发生网络的影响 １ ８ ８ １

加入液氮研磨成粉状ꎬ无菌转移至灭菌 ＥＰ 管内ꎮ 上述计算中所得到的 Ｐ 值ꎬ根据属间 Ｓｐｅａｒｍａｎ 相
各处理组根、茎和叶样品分别准备 ３ 份ꎮ 关系数( ｜ ｒ ｜ >０.７) 和 Ｐ<０.００１ 作为阈值进行物种
１.５ ＤＮＡ 提取和高通量测序 间共发生网络图构建ꎮ 利用 Ｇｅｐｈｉ 软件(０.１０.１)

ＤＮＡ 提取采用 ＦａｓｔＤＮＡ Ｓｐｉｎ Ｋｉｔ ｆｏｒ Ｓｏｉｌ 试剂 构建分子生态网络( ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｎｅｔｗｏｒｋｓꎬ
®
盒(ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓꎬ ＵＳＡ)ꎬ按照说明书的提取步 ＭＥＮｓ)ꎬ并计算包括网络平均连通度、网络直径、
骤进行ꎬ将提取得到的总 ＤＮＡ 通过微量分光光度 网络密度、平均聚类系数、模块化、模块个数等在

计( ＮａｎｏＤｒｏｐ２ ０００ꎬＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬＵＳＡ) 内的网络拓扑属性ꎮ
测定 ＤＮＡ 浓度和纯度ꎮ １.７ 数据处理
采用引物 ３３８Ｆ:５′￣ＡＣＴＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣ 使用 ＳＰＳＳ ２６.０ 和 Ｅｘｃｅｌ 进行数据的整理分析
ＡＧ￣３′和 ８０６Ｒ:５′￣ＧＧＡＣＴＡＣＨＶＧＧＧＴＷＴＣＴＡＡＴ￣３′ 和绘图ꎬ实验数据用平均值±标准差ꎮ 服从正态分
对 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因的 Ｖ３ －Ｖ４ 区进行扩增ꎬ扩增体 布和 满 足 方 差 齐 性 时ꎬ 采 用 ｔ 检 验、 方 差 分 析
￣１ (ＡＮＯＶＡ)法分析数据差异ꎬ不满足正态分布和方
系:５×ＦａｓｔＰｆｕ Ｂｕｆｆｅｒ ４ μＬꎬ２.５ ｍｍｏｌＬ ｄＮＴＰｓ ２
￣１ 差 齐 性 时 采 用 非 参 数 Ｗｉｌｃｏｘｏｎ 秩 和 检 验 及
μＬꎬ上游引物(５ μｍｏｌＬ ) ０.８ μＬꎬ下游引物(５
￣１
μｍｏｌ Ｌ ) ０. ８ μＬꎬ ＦａｓｔＰｆｕ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ０. ４ Ｋｒｕｓｋａｌ￣Ｗａｌｌｉｓ Ｈ 秩和检验ꎮ
μＬꎬＢＳＡ ０.２ μＬꎬ基因组 ＤＮＡ １０ ｎｇꎬ补 ｄｄＨ Ｏ 至
２
２０ μＬꎮ ＰＣＲ 反应体系:预变性 ９５ ℃ ３ ｍｉｎꎬ３０ 个 ２ 结果与分析
循环(变性 ９５ ℃ ３０ ｍｉｎꎬ退火 ５５ ℃ ３０ ｓꎬ延伸 ７２
℃ ４５ ｓ)ꎬ稳定延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ１０ ℃ 保存直至反 ２.１ 艾纳香器官生物量及 Ｃｄ 含量
应结束ꎮ 每个样本 ３ 个重复ꎬ使用 ２％的琼脂糖凝 由图 １:ａ 可知ꎬ与 Ｃｄ０ 处理相比ꎬＣｄ２ 处理下
胶电 泳 分 离 ＰＣＲ 产 物ꎬ 使 用 ＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ Ｇｅｌ 艾纳香各器官生物量均增加且茎的生物量增加明
Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 纯化 ＰＣＲ 产物ꎬ测序工作交由上海 显(Ｐ<０.０１)ꎬ由此可见ꎬ２.０ ｍｇｋｇ Ｃｄ 处理对艾
￣１
美吉生物医药科技有限公司完成ꎮ 纳香生长无抑制作用ꎬ进而说明艾纳香对一定量
１.６ 高通量数据处理及分析 的 Ｃｄ 有耐受性ꎮ
使用 Ｆａｓｔｐ 软件和 ＦＬＡＳＨ 软件对原始测序序 Ｃｄ 含量测定结果( 图 １:ｂ) 表明ꎬ艾纳香各器
列进行质控及拼接ꎬ过滤 ｒｅａｄｓ 尾部质量值 ２０ 以 官 Ｃｄ 积累量大小表现为叶>茎>根ꎬ并且 Ｃｄ２ 处理
下的碱基ꎬ允许 ｏｖｅｒｌａｐ 区最大错配比率为 ０.２ꎬ根 下各器官 Ｃｄ 含量显著高于 Ｃｄ０ 处理( Ｐ<０.００１)ꎮ
据 ９７％ 的 相 似 度 对 序 列 进 行 操 作 分 类 单 元 此外ꎬ由图 １:ｃ 可知ꎬ艾纳香对外源 Ｃｄ 的转移系
(ｏｐｅｒａｔｉｏｎａｌ ｔａｘｏｎｏｍｉｃ ｕｎｉｔꎬＯＴＵ)聚类ꎬ去除所有样 数达到 １５.８２ꎬ富集系数达到 ７.３９ꎬ说明艾纳香对
本中注释到的叶绿体和线粒体序列ꎬ将所有样本 Ｃｄ 具有较强的转移和富集能力ꎮ
序列抽平至 ２ ０００ꎬ利用 ＲＤＰ ｃｌａｓｓｉｆｉｅｒ 分类网站和 ２.２ Ｃｄ 对艾纳香内生细菌 α 多样性影响
Ｓｉｌｖａ １６ ｒＲＮＡ 基因数据库进行 ＯＴＵ 物种分类学注 使用 Ｆａｓｔｐ、ＦＬＡＳＨ 软件对 １８ 个样本的原始测
释ꎬ置信度阈值为 ７０％ꎮ 计算 α 多样性( Ｓｈａｎｎｏｎ 序结果进行过滤、拼接、筛选等后续处理ꎬ共获得
指数、Ｓｉｍｐｓｏｎ 指数、Ｓｏｂｓ 指数、Ｃｈａｏ１ 指数、Ａｃｅ 指 ９６９ ５３２ 条优化序列ꎬ其中 Ｃｄ０ 处理样本平均获得
数)ꎬ并采用 Ｗｉｌｘｏｃｏｎ 秩和检验进行 α 多样性组间 １５９ ４２１ 条 优 化 序 列ꎬ Ｃｄ２ 处 理 样 本 平 均 获 得

差异 分 析ꎮ 用 线 性 判 别 分 析 ( Ｌｉｎｅａｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ １４９ ７１１条优化序列ꎮ 在 ９７％相似度下ꎬ序列被注
ａｎａｌｙｓｉｓ Ｅｆｆｅｃｔ ＳｉｚｅꎬＬＥｆＳｅ) 确定同一处理不同器官 释得到 １ ４２１ 个 ＯＴＵｓꎬＣｄ０ 和 Ｃｄ２ 处理分别得到
间或不同处理组间相同器官属水平差异显著的内 ６１６ 个和 ８０５ 个 ＯＴＵｓ(表 １)ꎮ 为验证艾纳香样本
生细菌类群( ＬＤＡ 值>２)ꎮ 使用基于欧氏距离的 的测序深度能否充分反映艾纳香实验样本的内生

冗余分析(ｒｅｄｕｎｄａｎｃｙ ａｎａｌｙｓｉｓꎬ ＲＤＡ)探讨土壤 Ｃｄ 菌多样性ꎬ本实验绘制了 Ｃｈａｏ１ 指数的稀释曲线ꎬ
和器官 Ｃｄ 对艾纳香细菌群落结构的影响ꎮ 对各 如图 ２ 所示ꎬ稀释曲线持续增高后呈平稳状态ꎬ说

器官中所有属(ｇｅｎｕｓ) 间进行 Ｓｐｅａｒｍａｎ 相关分析ꎬ 明测序量充足ꎬ支持后续的分析ꎮ
得到相关系数矩阵和 Ｐ 值矩阵ꎬ并采用 Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ 艾纳香根、茎、叶内生菌 α 多样性分析结果见
ａｎｄ Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ｆａｌｓｅ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｒａｔｅ ( ＦＤＲ) 方法矫正 表 １ꎮ 相同处理条件下ꎬ 不同器官内生菌丰富度