Page 110 - 《广西植物》2024年第12期
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２ ２ ６ ８ 广 西 植 物 ４４ 卷
１.５ ＳｍＰＡＤ４ 启动子扩增 ＰＡＤ４ 蛋白的系统进化树( 图 ２) 发现ꎬ水母雪兔子
依据已克隆出的 ＳｍＰＡＤ４ 基因组序列设计 ３ ＳｍＰＤＡ４ ( ＷＰＡ９３９９０. １ ) 和 刺 苞 菜 蓟 ( ＸＰ ＿
个巢式下游特异性引物( 表 １)ꎮ 按照 Ｍｉｎｉ ＢＥＳＴ ０２４９６２８８４. １、 ＸＰ ＿ ０２４９６２８８５. １ )、 莴 苣 ( ＸＰ ＿
通用型 ＤＮＡ 提取试剂盒提取高浓度的水母雪兔 ０２３７３７０９８.１)、小蓬草(ＸＰ＿０４３６２３４９６.１)、向日葵
子 ＤＮＡꎮ 采用 ｈｉ￣ＴＡＩＬ ＰＣＲ(Ｌｉｕ ＆ Ｃｈｅｎꎬ ２００７ꎻ郭 (ＸＰ＿０２１９８９６８１.１) 等 ＰＡＤ４ 蛋白亲缘关系较近ꎬ
佳磊等ꎬ２０２０) 的方法扩增 ＳｍＰＡＤ４ 启动子序列ꎮ 其 中 进 化 距 离 最 近 的 是 刺 苞 菜 蓟 ( ＸＰ ＿
分别进行预扩增、第一轮扩增和第二轮扩增 ＰＣＲ ０２４９６２８８４.１、ＸＰ ＿０２４９６２８８５.１)ꎮ 蛋白多序列比
反 应ꎮ 扩 增 的 启 动 子 序 列 采 用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 对(图 ３)显示水母雪兔子 ＰＡＤ４ 与刺苞菜蓟相似
( ｈｔｔｐｓ: / / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ/ 度最高ꎮ 将 ＳｍＰＡＤ４ 与菊科其他植物进行核苷酸
ｐｌａｎｔｃａｒｅ / ｈｔｍｌ)在线预测顺式作用元件ꎮ 和氨基酸序列比较发现ꎬ与刺苞菜蓟的核苷酸序
１.６ ＳｍＰＡＤ４ 基因的亚细胞定位 列相似度高达 ８７.１６％ꎬ与其他菊科的核苷酸序列
通过 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 寻找 ＳｍＰＡＤ４ 基因中带 相似度在 ７４％以上ꎬ与刺苞菜蓟的氨基酸序列相
有 Ｓａｃ Ⅰ和 Ｘｂａ Ⅰ的双酶切位点ꎬ之后加入 ５′和 似度高达 ８７.６６％ꎬ与其他菊科的核苷酸序列相似
３′接头引物合成 ＰＡＤ４￣２３００Ｆ 和 ＰＡＤ４￣２３００Ｒ 引物 度在 ７３％以上ꎮ
(表 １)ꎮ 通过 ＰＣＲ 扩增该基因的 ＣＤＳ 区ꎬ对 ＰＣＲ ＳｍＰＡＤ４ 含有多个磷酸化位点( 图 ４:Ａ)ꎬ其
产物和 ｐＣＡＭＢＩＡ２３００￣ＧＦＰ 载体进行双酶切ꎮ 使 中丝氨酸磷酸化位点最多且多个位点预测值在
用同源重组方法用 Ｔ４ＤＮＡ 连接酶构建融合表达 ０.９ 以上ꎬ表明 ＳｍＰＡＤ４ 蛋白可受磷酸化作用调
载体 ＰＡＤ４￣２３００ꎮ 通过热激法将其转化大肠杆菌 控ꎮ 其蛋白质二级结构预测( 图 ４:Ｂ) 显示ꎬ该序
ＤＨ５α 感受态细胞并筛选出阳性克隆ꎬ挑取阳性菌 列主要含有 α￣螺旋、延伸链、β￣折叠和无规卷曲ꎮ
落进行菌落 ＰＣＲ 检测ꎮ 通过液氮冻融法将重组质 其中ꎬα￣螺旋有 ３１４ 个氨基酸ꎬ占 ５０.５６％ꎻ延伸链
粒转化农杆菌 ＧＶ３１０１ꎬ再侵染本氏烟草叶片进行 有 ５１ 个氨基酸ꎬ占 ８.２１％ꎻβ￣折叠有 １８ 个氨基酸ꎬ
瞬时表达ꎬ培养 ２ ~ ３ ｄ 后ꎬ使用含 ２３００￣ＧＦＰ 空载 占 ２.９０％ꎻ无规卷曲有 ２３８ 个氨基酸ꎬ占 ３８.３３％ꎮ
体的农杆菌作为对照ꎬ利用 ＦＶ１０￣ＡＳＷ 激光共聚 α￣螺旋、延伸链和无规卷曲贯穿于整个氨基酸链ꎬ
焦显微镜观察叶片中的荧光信号ꎮ β￣折叠只有一点点且散布在 α￣螺旋附近ꎮ 利用
ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 对 ＳｍＰＡＤ４ 蛋白三级结构的预测
２ 结果与分析 见图 ４:Ｃꎮ 并且该蛋白 Ｎ 端具有保守性较高的 α /
β 水解酶折叠结构域ꎬ在菊科植物的进化过程中具
２.１ ＳｍＰＡＤ４ 基因 ｃＤＮＡ 全长的克隆 有高度的保守性ꎮ Ｃ 端包含 ＥＤＳ１￣ＰＡＤ４( ＥＰ) 结
通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩 增 出 ５７４ ｂｐ 的 保 守 片 段ꎬ 构域ꎬ是稳定异二聚化所必需的ꎬ包括类脂酶蛋白
３′ ＲＡＣＥ和 ５′ ＲＡＣＥ 反应分别扩增出 １ １５０ ｂｐ 和 家族( ＥＤＳ１、ＰＡＤ４、ＳＡＧ１０１)ꎬ这组蛋白质可参与
１ ３５９ ｂｐ 的片段( 图 １)ꎮ 该基因 ｃＤＮＡ 全长２ ０４７ 细胞表 面 和 细 胞 内 免 疫 受 体 的 信 号 传 导ꎬ 因 此
ｂｐ(ＧｅｎＢａｎｋ 登录号 ＯＲ７６６０３８)ꎬ其中 包 括１ ８６６ ＰＡＤ４ 具有特定的结构域功能ꎮ
ｂｐ 的开放阅读框ꎬ编码 ６２１ 个氨基酸ꎬ并进行了 ２.３ ＳｍＰＡＤ４ 基因的启动子扩增
ｃＤＮＡ 全长验证ꎮ 通过 ｈｉ￣ＴＡＩＬ ＰＣＲ 的方法扩增出 １ ０４９ ｂｐ 的
２.２ ＳｍＰＡＤ４ 基因的生物信息学分析 ＳｍＰＡＤ４ 启动子序列( 图 ５)ꎮ 通过 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ 在
ＳｍＰＡＤ４ 基因共编码 ６２１ 个氨基酸ꎬ分子式为 线预测发现该启动子区域除大量的 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ 和
Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ分子量为 ７０.２２ ｋＤａꎬ等电点 ＣＴＡＡ￣ｂｏｘ 启动子顺式元件外ꎬ还包含光响应元件
３１６３ ４９０６ ８４８ ９１０ ２６
为 ８.１８ꎬ蛋白脂肪指数为 ８７.１３ꎬ无信号肽ꎬ总平均 (Ｂｏｘ ４ 和 ＧＴ１￣ｍｏｔｉｆ)、低氧应答元件( ＡＲＥ)、茉莉
亲水系数为－ ０.１９４ꎬ不稳定系数为 ４０.４８ꎬ为碱性 酸甲酯(ＭｅＪＡ)应答元件( ＣＧＴＣＡ￣ｍｏｔｉｆ 和 ＴＧＡＣＧ￣
亲水性不稳定蛋白ꎮ 跨膜结构预测结果显示有跨 ｍｏｔｉｆ)、干旱 ( ＭＢＳ) 和 生 长 素 应 答 元 件 ( ＡｕｘＲＲ￣
膜区域ꎬ说明 ＳｍＰＡＤ４ 蛋白属于跨膜蛋白ꎮ 将水 ｃｏｒｅ)等顺式作用元件(表 ２)ꎮ 这说明 ＳｍＰＡＤ４ 基
母雪兔子 ＳｍＰＡＤ４ 基因预测的编码氨基酸序列ꎬ 因可参与光信号、低氧、干旱和茉莉酸甲酯以及
通过 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 法构建 ＳｍＰＡＤ４ 和其他物种 ＷＲＫＹ 转录因子的结合位点( Ｗ￣ｂｏｘ) 等信号胁迫
