Page 109 - 《广西植物》2024年第12期

１２ 期 韦鎔宜等: 水母雪兔子通气组织形成相关基因 ＳｍＰＡＤ４ 的克隆及表达分析 ２ ２ ６ ７

生型通气组织形成过程( Ｍüｈｌｅｎｂｏｃｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７ꎻ 提取水母雪兔子总 ＲＮＡꎬ检测 ＲＮＡ 质量合格后利
Ｋａｒｐｉńｓｋｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ Ｙｏｕｓｓｅｆ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ 用 Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＴＭⅡ１ｓｔ ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ
Ｂｅｒｎａｃｋｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ 在水稻中ꎬ朱静雯(２０１４) (ＴａＫａＲａ)试剂盒反转 ｃＤＮＡ 第一链ꎮ 根据简并引
通过改变氮素含量来刺激水稻ꎬ使 ＯｓＰＡＤ４ 改变对 物扩增出的中间片段设计 ２ 个 ３′￣ＲＡＣＥ 和 ２ 个 ５′￣
氮素的响应模式ꎬ从而来调控细胞程序性死亡诱 ＲＡＣＥ 的 巢 式 ＰＣＲ 特 异 性 引 物 ( 表 １ )ꎬ 利 用

® ＲＡＣＥ ５′ / ３′ Ｋｉｔ 试 剂 盒 进 行 ＲＡＣＥ 实
导通气组织形成ꎮ 在葡萄中ꎬＶｖＰＡＤ４ 与 ＶｖＥＤＳ１ ＳＭＡＲＴｅｒ
形成稳定的分子复合物来适应非生物胁迫和调控 验ꎬ并对 ＰＣＲ 产物进行 １％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ
细胞死亡(Ｇａｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ꎻＴａｎｄｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 将符合大小的条带回收并进行蓝白斑筛选ꎬ将阳
在大豆中ꎬＧｍＰＡＤ４ 是防御信号传导所必需ꎬ并且 性菌落挑出送生物公司测序ꎮ 二轮巢式 ＰＣＲ 扩增

参与调控细胞死亡和生物胁迫应答过程( Ｗａｎｇ ｅｔ 得到的序列与中间片段进行拼接得到水母雪兔子
ａｌ.ꎬ ２０１４ꎻＰａｎｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 目前ꎬＰＡＤ４ 基因对 ＳｍＰＡＤ４ 基因的 ｃＤＮＡ 全长ꎬ根据全长序列设计引

通气组织形成及其调控研究主要集中于拟南芥、 物进行验证ꎮ
水稻和烟草等植物( Ｂｕｂｉｃｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６ꎻＨａｎｌｉｎｇ ｅｔ １.３ ＳｍＰＡＤ４ 基因的生物信息学分析
ａｌ.ꎬ ２０２４)ꎬ对 ＰＡＤ４ 基因在水母雪兔子逆境适应 利用 Ｏｐｅｎ Ｒｅａｄｉｎｇ Ｆｒａｍｅ Ｆｉｎｄｅｒ(ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ)
过程中的功能研究尚未明确ꎮ 寻找开放阅读框和序列编码产物ꎻ通过 ＰｒｏｔＰａｒａｍ
鉴于此ꎬ本研究以自然生长于青藏高原地区 工具( ｈｔｔｐ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 进行氨基
的水母雪兔子为试验材料ꎬ通过分子生物学技术 酸序列等电点、分子量和不稳定系数等理化性质
克隆与通气组织形成相关的基因 ＳｍＰＡＤ４ 及扩增 分析ꎻ用 Ｐｆａｍ( ｈｔｔｐ: / / ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ / ) 进行保守结
其启动子ꎬ并研究该基因在紫外和低氧胁迫条件 构域 分 析ꎬ 通 过 ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐ: / / ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ. ｆｒ) 和
下的表达ꎬ从而分析基因与生态环境之间的关系ꎬ ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.
以期为水母雪兔子的分子适应机制和高山植物功 ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )预测 ＳｍＰＡＤ４ 蛋白的二级、三级结构ꎻ
能生态学研究提供科学依据ꎮ 借助 ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔｐ 和 ＤＮＡＭＡＮ ５.０ 软件进行同源
序列 比 对ꎻ 将 同 源 性 高 的 ＰＡＤ４ 基 因 蛋 白 使 用
１ 材料与方法 ＭＥＧＡ １１ 构建水母雪兔子 ＳｍＰＡＤ４ 与其他植物的
同源蛋白系统进化树ꎻ通过 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ( ｈｔｔｐｓ: / /
１.１ 材料和处理 ｗｗｗ.ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ.ｃｏｍ / ｗｏｌｆ￣ｐｓｏｒ) 对 ＳｍＰＡＤ４ 进行亚细
取青藏高原东北部祁连山支脉( 青海西宁ꎬ 胞定位预测ꎮ
１０１°４１′ Ｅ、３７°３６′ Ｎ)的水母雪兔子植株及种子进 １.４ ＳｍＰＡＤ４ 基因的表达分析
行相关实验ꎮ 于开花期采集幼嫩叶片用于基因克 用野外采取的水母雪兔子组织(根、茎、叶) 为
隆和启动子扩增ꎮ 实验材料ꎬ提取 ＲＮＡ 反转成 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ进行野
将采集的种子于实验室培养至长出两片真叶 外环境下的组织表达分析ꎮ 以实验室培养的水母
(约 ７０ ｄ)ꎬ 参 照 师 生 波 等 ( ２００６) 和 蒋 欣 悦 等 雪兔子实生苗为实验材料进行紫外、低氧两种胁
(２０２３)的方法对其进行紫外胁迫和低氧胁迫ꎬ并 迫ꎬ于处理 １、２、４、６、１２ ｈ 后采集水母雪兔子不同组
于胁迫处理 １、２、４、６、１２ ｈ 后取样ꎬ用于基因的组 织(根、茎、叶) 提取 ｃＤＮＡ 进行环境胁迫的组织表

织表达分析ꎮ 达分析ꎮ 本实验参照郭佳磊等(２０２０) 和蒋欣悦等
１.２ ＳｍＰＡＤ４ 基因 ｃＤＮＡ 全长的克隆 (２０２３)的方法以 ＵＰＬ７ 作为内参基因ꎬ设计荧光定
从 ＮＣＢＩ 下 载 菊 科 植 物 刺 苞 菜 蓟 ( Ｃｙｎａｒａ 量引物(表 １)ꎬ每组处理进行 ３ 个生物学重复ꎬ按照
ｃａｒｄｕｎｃｕｌｕｓ )、 莴 苣 ( Ｌａｃｔｕｃａ ｓａｔｉｖａ )、 向 日 葵 ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ Ⅱ说明书流程进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲꎮ

(Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ)和小蓬草(Ｅｒｉｇｅｒｏｎ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ) 反应程序:９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９５ ℃变性 １０ ｓꎬ６０ ℃
已上传的 ＰＡＤ４ 的 ＣＤＳ 区域ꎬ利用 ＤＮＡＭＡＮ ５.０ 退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃延伸 ３０ ｓ(４０ 个循环)ꎮ 数据分析采
－ΔΔＣｔ 计算水母雪兔子 ＳｍＰＡＤ４ 基因在根、茎和叶
比对后设计简并引物(表 １)ꎮ 用 ２
以野外采集的水母雪兔子叶片为实验材料ꎬ 中的表达量ꎬ并使用 ＳＰＳＳ ２６、Ｅｘｃｅｌ ２０２１ 和 Ｏｒｉｇｉｎ
利用 ＭｉｎｉＢｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 试剂盒 ２０２１ 进行分析与制图ꎮ