Page 67 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 朱云娜等: 芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因克隆及表达分析 ２ ６ ９

课题组以紫茎埃芥与棒菜经多代回交及自交ꎬ选育 普洛麦格(北京)生物技术公司的 Ｅａｓｔｅｐ Ｓｕｐｅｒ 植
®
了紫薹－绿薹芥菜近等位基因系(２０１￣４０２)ꎮ 该文 物 总 ＲＮＡ 提 取 试 剂 盒 和 ＧｏＳｃｒｉｐｔ ＴＭ Ｒｅｖｅｒｓｅ
以紫薹－绿薹芥菜近等位基因系为材料ꎬ采用同源 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ 分 别 提 取 总 ＲＮＡ 和 合 成
克隆方法对芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因及启动子进行克 ｃＤＮＡꎮ
隆ꎬ通过生物信息学软件对其编码的蛋白序列进行 １.５ 基因克隆及阳性克隆鉴定
同源性分析和系统进化分析、启动子序列的顺式作 根据 十 字 花 科 基 因 组 数 据 库 ( Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ
用元件分析ꎬ并分析其在紫薹、绿薹近等位基因系 Ｄａｔａｂａｓｅ)中的芥菜基因组数据 Ｂｒａｊｕ＿ｔｕｍ＿Ｖ２.０ 中
芥菜中的表达情况及其花青素含量之间的关系ꎬ拟 的 ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因序列(ＢｊｕＶＢ０５Ｇ２１７３０) 设计引物
探讨以下问题:(１)ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因及启动子序列在 (表 １)ꎮ
紫薹芥菜和绿薹芥菜中是否存在差异ꎻ(２)紫薹、绿 以表 １ 中 ＧＳＴＦ１２ 为 引 物ꎬ以 紫 薹 芥 菜 薹 茎
薹芥菜薹茎花青素含量分析ꎬＢｊＧＳＴＦ１２ 基因在紫茎 ＤＮＡ、ｃＤＮＡ 样品分别为模板ꎬ克隆芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２

芥菜和绿茎芥菜中的表达情况ꎻ(３) 芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因ꎮ ＰＣＲ 产物回收扩增得到的基因产物ꎬ连接
的互作蛋白分析ꎮ 本研究结果将为探究紫薹和绿 到 ｐＭＤ２０￣Ｔ 载体ꎬ并转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 感受
薹芥菜花青素含量差异提供信息ꎬ为进一步解析 态细胞ꎬ经过 ＰＣＲ 鉴定后ꎬ选取阳性克隆送到广州
ＢｊＧＳＴＦ１２ 在芥菜薹茎花青素积累中的作用奠定基 擎科生物技术有限公司进行测序ꎮ
础ꎬ为芥菜种质资源的有效利用与合理保护等提供 １.６ 生物信息学分析
一定的理论依据ꎮ 参照表 ２ 所列的生物信息学软件或网址对芥
菜 ＧＳＴＦ１２ 基因及其编码氨基酸进行分析ꎮ
１ 材料与方法 １.７ ＢｊＧＳＴＦ１２ 在紫薹、绿薹芥菜薹茎中的表达量
分析
１.１ 材料 根据 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ® Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ Ｔａｑ 进行荧光
ＴＭ
供试材料为课题组选育紫薹－绿薹芥菜近等 定量 ＰＣＲ 分析ꎬ以 Ａｃｔｉｎ２ 为内参基因ꎬ使用 ２ －ΔΔＣｔ
位基因系(２０１￣４０２)ꎮ ２０２２ 年 １０ 月至次年 ２ 月ꎬ 计算基因相对表达量(Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００２)ꎮ
将芥菜种植于广东省韶关市韶关学院生物与农业 １.８ 芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 启动子的克隆与顺式作用元
学院生态园连栋温室内ꎮ 件分析
１.２ 试验材料的种植和取样 以紫薹、绿薹芥菜基因组 ＤＮＡ 为模板ꎬ以表 １
芥菜种子用 ７.５％的 ＮａＣｌＯ 消毒 １０ ｍｉｎꎬ用无菌 中 ＧＳＴＦｐｒｏ 为引物ꎬ克隆芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 启动子序
水清洗 ４~ ５ 次ꎬ将种子播种于泥炭 ∶ 蛭石 ＝ ３ ∶ １基 列ꎬ连接 ｐＭＤ２０￣Ｔ 载体ꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ５α 感受
质中进行育苗ꎬ待芥菜幼苗长至三叶一心进行定 态 细 胞 后ꎬ 挑 选 阳 性 克 隆 进 行 测 序ꎮ 利 用
植ꎬ统一水肥管理ꎬ在移整地时ꎬ按照每 ６６７ 平方米 ＤＮＡＭＡＮ 软件对 ２ 个品种的启动子序列进行比
一次性施入 ５０ ｋｇ 复合肥( Ｎ －Ｐ Ｏ －Ｋ 为 １５ － ５ － 对ꎬ利用 Ｐｌａｎｔｃａｒｅ 网站对其启动子序列进行顺式
２ ５ ２
２５)ꎮ 移栽 ４０ ｄ 后ꎬ待其抽薹ꎬ选取生长状态一致的 作用元件分析ꎬ并利用 ＴＢｔｏｏｌｓ 对作用元件进行可
紫薹芥菜、绿薹芥菜植株ꎬ取新鲜茎ꎬ撕取表皮后剪 视化(Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ
碎ꎬ液氮速冻后ꎬ保存在－８０ ℃ 冰箱中备用ꎬ每个样 １.９ 统计分析与作图

品取 ３ 个生物重复ꎬ每个生物重复取 ４~６ 株ꎮ 利用 Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ ２０１０ 进行数据整理ꎬ利用
１.３ 芥菜薹茎花青素含量的测定 ＳＰＳＳ １９. ０ 进 行 Ｄｕｎｃａｎ ’ ｓ 显 著 性 分 析ꎬ 利 用
取 ０.０５ ｇ 左右紫薹、绿薹芥菜表皮ꎬ切碎ꎬ放 ＳｉｇｍａＰｌｏｔ １１.０ 进行作图ꎮ
入 ５ ｍＬ 的 １％ＨＣｌ 甲醇溶液室温避光过夜浸提ꎬ利

用 ＵＶ￣２６００ 型紫外分光光度计测定波长在 ５３０ ｎｍ ２ 结果与分析
下的吸光值(Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ
１.４ 基因组 ＤＮＡ、总 ＲＮＡ 的提取及 ｃＤＮＡ 合成 ２.１ 芥菜 ＢｊＧＳＴＦ１２ 基因的克隆
参照天根生化科技(北京) 有限公司的新型基 提取紫薹芥菜薹茎 ＤＮＡ 和总 ＲＮＡꎬ将总 ＲＮＡ
因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取芥菜基因组 ＤＮＡꎬ参照 反转录为 ｃＤＮＡꎬ以其为模板ꎬ利用表 １ 中 ＧＳＴＦ１２￣