Page 101 - 《广西植物》2025年第1期
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１ 期 单筱涵等: 异质生境下山东银莲花的转录组分析及 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 分子标记开发 ９ ７
利用 ＳＳＲ 标记ꎬ使得山东银莲花在分子标记方面 量ꎬ计算差异倍数ꎬ并采用 ＮＢ( 负二项分布检验的
的研究难以深入ꎮ 方式)对 Ｒｅａｄｓ 数进行差异显著性检验ꎬ以差异倍
本研究以异质生境下山 东 银 莲 花 为 研 究 对 数 ｜ ｌｏｇ ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ ｜ >１ 及差异显著性检验结果 Ｐ<
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象ꎬ利用 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 高通量测序技术获取其转录组数 ０.０５ 为标准筛选差异表达基因ꎮ
据ꎬ并进行组装和功能注释ꎬ得到其差异表达基因 １.３ 引物设计与筛选
和大量丰富的 ＳＳＲ 位点ꎬ随后进行 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物 基于山东银莲花转录组测序结果ꎬ使用软件
设计并加以验证ꎬ以期探讨山东银莲花在异质生 ＭＩＳＡ(Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)进行 ＳＳＲ 预测ꎬ设置重复
境中的生态适应机制ꎬ并开发适用的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 分 基序的长度为 １、２、３、４、５ 和 ６ꎬ最小重复次数为
子标记ꎬ填补山东银莲花在以上两方面的研究空 １０ 次、６ 次、５ 次、５ 次、５ 次和 ５ 次ꎻ两个微卫星之
白ꎬ为今后其遗传多样性分析、种质资源评价、功 间的序列长度不超过 １００ ｂｐ 即被认定为复合微卫
能基因标记和分子辅助育种等研究奠定基础ꎬ进 星ꎮ ＳＳＲ 作为一种用途广泛的分子标记ꎬ其多态
一步实现物种的保护与利用ꎮ 性水平越高则应用价值越大( 郑燕等ꎬ２０１２)ꎮ 当
ＳＳＲ 长度≥２０ ｂｐ 时可显示出较高的多态性ꎬ长度
１ 材料与方法 在 １２ ~ ２０ ｂｐ 之间相对较低ꎬ在 １２ ｂｐ 以下则很低
(Ｔｅｍｎｙｋｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１)ꎮ 根据 ＳＳＲ 长度≥２０ ｂｐ、
１.１ 实验材料 去除复合型 ＳＳＲ 位点和容易与多腺苷化作用相混
本研究所用实验材料均为开花期的山东银莲 杂的 Ａ / Ｔ 重复基序的原则ꎬ将所有 ＳＳＲ 位点进行
花叶片ꎬ其中转录组测序材料于 ２０２１ 年 ６ 月取自 初步筛选后随机选择 １００ 对 ＳＳＲ 位点利用软件
山东省烟台市昆嵛山国家级自然保护区的泰礴顶 Ｐｒｉｍｅｒ３(Ｒｏｚｅｎ ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙꎬ ２０００) 进行引物设计ꎬ
和寒风岭(表 １)ꎬ引物筛选材料于 ２０２１ 年 ９ 月取 命名为 ＡＮＳ００１￣ＡＮＳ１００ꎬ送至北京六合华大基因
自青岛崂山和烟台昆嵛山( 表 ２)ꎮ 采集后用蒸馏 科技有限公司合成ꎮ
水清洗干净ꎬ立即放入液氮中冷冻ꎮ 转录组测序 利用青岛崂山滑溜口所采集样品通过 １％ 琼
由上海欧易生物医学科技有限公司完成ꎬ引物筛 脂糖凝胶电泳对 １００ 对引物进行筛选ꎬ以检测引
选材料带回实验室后采用改良的 ＣＴＡＢ 法( 闫苗 物有效性ꎮ ＰＣＲ 扩增体系为 ２０ μＬ:２×Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ
苗等ꎬ２００８)提取 ＤＮＡꎬ并利用 １％琼脂糖凝胶电泳 ４ μＬ、上下游引物(１０ μｍｏｌＬ ) 各 ２ μＬ、ＤＮＡ 模
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对所提取的 ＤＮＡ 进行检测ꎬ将检测合格的 ＤＮＡ 统 板 ２ μＬ 和 ｄｄＨ Ｏ１０ μＬꎮ 反应程序:９４ ℃ 预变性 ３
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一稀释 至 ２０ ｎｇ μＬ ꎬ放 入 － ２０ ℃ 冰 箱 中 保 存 ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃ 退火 ３５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ６０
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备用ꎮ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 终延伸 １０ ｍｉｎꎬ４ ℃ 保存ꎮ 随后
１.２ 转录组分析 将无法正确扩增或扩增产物大小与预期不符的引
Ｄｅ ｎｏｖｏ 拼 接: 使 用 Ｔｒｉｎｉｔｙ ( Ｍａｎｆｒｅｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ 物筛除ꎬ可正确扩增的引物利用样品 ＹＤ１( 烟台昆
２０１１) 软件 ｐａｉｒｅｄ￣ｅｎｄ 的拼接方法得到 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ 嵛山泰礴顶)、ＹＬ１( 烟台昆嵛山老铁山)、ＱＤ１( 青
序列ꎬ根据序列相似性以及长度ꎬ挑选出最长的一 岛崂山崂顶景区丹炉峰附近)、ＱＬ１( 青岛崂山滑
条作为 Ｕｎｉｇｅｎｅꎬ之后再利用 ＣＤ￣ＨＩＴ 软件聚类去 溜口)通过 ８％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染
冗余得到一套最终的 Ｕｎｉｇｅｎｅꎬ以此作为后续分析 显色的方法进行目的条带的分离和检测ꎬ筛选出
的参考序列ꎮ 具有多态性的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物ꎮ
功能 注 释: 利 用 ＤＩＡＭＯＮＤ ( Ｂｕｃｈｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２０１４) 软 件 将 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 比 对 到 ＮＲ、 ＫＯＧ、 ＧＯ、 ２ 结果与分析
Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、 ｅｇｇＮＯＧ、 ＫＥＧＧ 数 据 库 以 及 利 用
ＨＭＭＥＲ 软件比对 Ｐｆａｍ 数据库来进行 Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 的 ２.１ 转录组数据分析
功能分析ꎮ ２.１.１ 总体特征 对山东银莲花进行无参转录组
差异 表 达 基 因 筛 选: 利 用 ＤＥＳｅｑ ( Ａｎｄｅｒｓ ＆ 分析ꎬ共获得 ４２.３４ Ｇ 的 Ｃｌｅａｎ Ｄａｔａꎬ各样本的有效
Ｈｕｂｅｒꎬ ２０１２)软件对各个样本基因的 Ｃｏｕｎｔｓ 数目 数据 量 分 布 在 ６. ９８ ~ ７. １０ Ｇꎬ Ｑ３０ 碱 基 分 布 在
进行标 准 化 处 理ꎬ采 用 ＢａｓｅＭｅａｎ 值 来 估 算 表 达 ９３.６８％ ~ ９４.２０％之间ꎬ证明本次测序数据准确性
