Page 60 - 《广西植物》2025年第10期
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１ ７ ９ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
的操作如下:称取 １.０ ｍｇ 样品于圆底烧瓶中ꎬ滴入 入相应试剂ꎬ继续培养 ２４ ｈ 后取 ＲＡＷ ２６４.７ 细胞
￣１ 上清液ꎬ依 ＮＯ 试剂盒说明书于 ５５０ ｎｍ 处测定吸
３ ｍＬ ０.５ ｍｏｌＬ 盐酸ꎬ水浴 １.５ ｈ 使其充分水解ꎬ
随后加入阴离子交换树脂 ＩＲＡ ４００ 调至中性ꎬ过 光度ꎬ 按 以 下 公 式 计 算 样 品 对 ＬＰＳ 诱 导 ＲＡＷ
滤ꎬ滤液减压浓缩旋干ꎬ然后滴入含有 １.０ ｍｇ Ｌ￣半 ２６４.７ 细胞产生 ＮＯ 的抑制率( Ｈｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ
胱氨酸甲酯盐酸盐的吡啶溶液 ０.２ ｍＬꎬ摇匀后置 ＮＯ 抑 制 率 (％) ＝ [ ＯＤ － ＯＤ ] / [ ＯＤ －
ＬＰＳ 药物 ＬＰＳ
于 ６０ ℃ 水浴中反应 １ ｈꎬ再向反应物中滴入含有 ＯＤ 空白 ] ×１００ꎮ 实验平行 ４ 次ꎮ
１.０ ｍｇ 邻甲苯异硫氰酸酯的吡啶溶液 ０.２ ｍＬꎬ摇 数据统计:采用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５.０ 软件根据
匀后置于 ６０ ℃ 水浴中反应 １ ｈꎬ即得化合物糖部 抑制率与药物浓度计算出半数抑制浓度值( ＩＣ )ꎬ
５０
分的衍生物ꎬ标准糖的衍生物以相同方法得到ꎮ 并用均值±标准差( ｘ±ｓ) 表示ꎬ其显著性差异用 ｔ
化合物糖部分的衍生物与标准品衍生物分别在柱
检验来确定ꎮ
温箱温度 ４０ ℃ ꎬ流动相为 ２５％ 乙腈 －水ꎬ流速为
￣１
０.８ ｍＬｍｉｎ 的条件下进行高效液相色谱分析ꎬ ２ 结果与分析
通过对比它们的保留时间ꎬ确定糖的绝对构型ꎮ
结果发现ꎬ化合物 １、２、４－６、９、１０、１３、１９ 水解物中
２.１ 结构鉴定
含 Ｄ￣葡萄糖(ｔ ＝ １８.６６ ｍｉｎꎬ 正的旋光度)ꎬ 化合
Ｒ 化合物 １－１９ 的结构如图 １ 所示ꎮ
物 ７－９ 水解物中含 Ｌ￣鼠李糖( ｔ ＝ ２９.８８ ｍｉｎꎬ 负
Ｒ 化合物 １:黄色无定形粉末ꎮ ＨＲ￣ＥＳＩ￣ＭＳ 显示
的旋光度)ꎮ －
分子离子峰为 ｍ / ｚ:４８３.０７８ ３ [ Ｍ－Ｈ] ( 计算相对
１.３.３ ＮＯ 抑制活性 细胞培养:将灭活胎牛血清、
分 子 质 量 ４８３. ０７７ ５ )ꎬ 其 对 应 的 分 子 式 为
双抗( 青霉素和链霉素)、高糖 ＤＭＥＭ 培养 基 按
１
Ｃ Ｈ Ｏ － ꎮ Ｈ ＮＭＲ ( ａｃｅｔｏｎｅ￣ｄ ꎬ ５００ ＭＨｚ ) δ:
１０ ∶ １ ∶ ９０ 体 积 比 配 成 完 全 培 养 液ꎬ 然 后 把 ２０ １９ １４ ６
４.１１ ~ ３.５１ (３ＨꎬｍꎬＨ￣ｇｌｃ￣２－ ４)ꎬ４.３３ (１Ｈꎬｄｄꎬ
ＲＡＷ２６４. ７ 细胞悬液滴入含完全培养基的培养瓶
Ｊ ＝ １７. ７ꎬ ５. ５ Ｈｚꎬ Ｈ￣ｇｌｃ￣５)ꎬ ４. ５６ ( １Ｈꎬ ｄｄꎬ Ｊ ＝
中再置于含 ５％ ＣＯ 细胞培养箱中培养ꎬ培养箱的
２
１２.２ꎬ１. ９ ＨｚꎬＨ￣ｇｌｃ￣６ａ)ꎬ４. ４３ ( １ＨꎬｄｄꎬＪ ＝ １２. ２ꎬ
温度设置为 ３７ ℃ ꎬ２ ~ ３ ｄ 传代 １ 次ꎮ
５.２ ＨｚꎬＨ￣ｇｌｃ￣６ｂ)ꎬ５.６９ (１ＨꎬｄꎬＪ ＝ ７.９ ＨｚꎬＨ￣ｇｌｃ￣
检测药物对 ＲＡＷ ２６４.７ 细胞成活率的影响:
１)ꎬ７.１１ ( ２Ｈꎬ ｓꎬ Ｈ￣ｇａｌｌｏｙｌ￣２ꎬ６)ꎬ７. １５ ( ２Ｈꎬ ｓꎬ Ｈ￣
取对数生长期的 ＲＡＷ ２６４.７ 细胞制成悬液后滴入
１３
ｇａｌｌｏｙｌ￣２′ꎬ６′)ꎻ Ｃ ＮＭＲ ( ａｃｅｔｏｎｅ￣ｄ ꎬ１２５ ＭＨｚ) δ:
含完全培养基的培养瓶中ꎬ置于培养箱中培养ꎮ ６
６３.６ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣６)ꎬ６９. ９ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣４)ꎬ７２. ７ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣２)ꎬ
４
随后取对数生长期的细胞以每个 ５ × １０ 个ｍＬ ￣１
７４.９ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣５)ꎬ７６. ７ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣３)ꎬ９４. ８ ( Ｃ￣ｇｌｃ￣１)ꎬ
的密度接种于 ９６ 孔板中ꎬ每孔 １００ μＬꎮ 培养 ２４ ｈ
１０９.５ ( Ｃ￣ｇａｌｌｏｙｌ￣３ꎬ３′ꎬ５ꎬ５′)ꎬ１２０. ２ ( Ｃ￣ｇａｌｌｏｙｌ￣１ꎬ
后ꎬ分别设加药组和对照组ꎬ每组设 ４ 个平行孔ꎮ
１′)ꎬ１３８. ７ ( Ｃ￣ｇａｌｌｏｙｌ￣４ꎬ ４′)ꎬ １４５. ２ ( Ｃ￣ｇａｌｌｏｙｌ￣２ꎬ
继续培养 ２４ ｈ 后ꎬ弃去培养液ꎬ小心用 ＰＢＳ 洗 １
２′ꎬ６ꎬ６′)ꎬ１６５.６ ( Ｃ ＝ Ｏ)ꎬ１６６.８ ( Ｃ ＝ Ｏ)ꎮ 化合物
￣１
遍ꎬ再每孔加入新鲜培养液和 ＭＴＴ (１ ｍｇｍＬ )
水解得到的糖衍生化后ꎬ将糖的衍生物与 Ｄ￣葡萄
溶液ꎬ于培养箱中作用 ４ ｈ 后ꎬ吸出上清液并每孔
糖对照品衍生物进行 ＨＰＬＣ 检测ꎬ它们的保留时
加入 １００ μＬ 的 ＤＭＳＯꎬ充分振荡至结晶溶解后ꎬ使
间一致ꎬ确定化合物 １ 中的糖为 Ｄ 葡萄糖ꎮ 以上
用酶 标 仪 检 测 各 孔 在 ５７０ ｎｍ 处 的 吸 收 值 ( ＯＤ
数据与文献( 刘伟等ꎬ２０１７) 报道的基本一致ꎬ故
值)ꎬ按以下公式计算细胞活力:细胞活力(％) ＝
鉴定该化合物为 １ꎬ６￣二￣Ｏ￣没食子酰基￣β￣Ｄ￣葡萄
(ＯＤ 实验组 / ＯＤ 对照组 ) ×１００ꎮ 实验平行 ４ 次ꎮ
糖苷ꎮ
￣１
测 定 ＮＯ 抑 制 率: 对 在 １０ μｍｏｌ Ｌ 和 ４０
μｍｏｌＬ 时对 ＲＡＷ ２６４.７ 细胞活力没有显著影 化合物 ２: 白 色 粉 末ꎬ [ α] ２５ － ６. ５ ( ｃ ０. ５５ꎬ
￣１
Ｄ
响的化合物ꎬ取 ＲＡＷ ２６４.７ 细胞传代后ꎬ用培养液 ＭｅＯＨ)ꎮ ( ＋)ＨＲ￣ＥＳＩ￣ＭＳ 显示分子离子峰为 ｍ / ｚ:
＋
稀释细胞至合适的浓度ꎬ接种到 ９６ 孔板中ꎬ化合 ４２９. １３７ ０ [ Ｍ ＋ Ｎａ ] ( 计 算 相 对 分 子 质 量
物设置不同剂量与 ＬＰＳ 作用ꎬ并设计空白组( 只加 ４２９.１３７ ３)ꎬ其对应的分子式为 Ｃ Ｈ Ｏ Ｎａ ꎮ Ｈ
＋
１
１ ７ ２６ １１
ＤＭＥＭ 培养液)和阳性对照组(地塞米松)ꎬ每组设 ＮＭＲ ( ＤＭＳＯ￣ｄ ꎬ５００ ＭＨｚ) δ:６. ６２ ( ２Ｈꎬ ｓꎬ Ｈ￣２ꎬ
６
４ 个平行孔ꎮ 接种 ５ ｈ 后ꎬ按照上述分组设置ꎬ加 ６)ꎬ４.４８ (１ＨꎬｄꎬＪ ＝ ５.２ ＨｚꎬＨ￣７)ꎬ３.６４ (１Ｈꎬｍꎬ
