Page 94 - 《广西植物》2025年第3期

４ ７ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
切酶法且克隆测序烟草( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ)ꎬ获得 ｂａｒｃｏｄｅ 文库ꎬ便可获得完整或几近完整的质体基
首条质体基因组序列ꎮ 随后该方法被 ＰＣＲ 扩增和 因组序列ꎬ这为基于馆藏标本遗传信息的生物学
双脱氧核苷酸末端终止法(或称 Ｓａｎｇｅｒ 测序法) 替 研究带来了新的机遇ꎮ Ａｌｓｏｓ 等(２０２０) 对上千份
代( Ｔａｂａｒｌｅｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９１)ꎮ 如 今ꎬ 借 助 二 代 测 序 馆藏标本和硅胶干燥材料进行比较研究ꎬ发现硅
(ｎｅｘｔ￣ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ＮＧＳ)的全基因组浅层 胶干燥材料的质体基因组组装成功率大于馆藏标
测 序 ( ｇｅｎｏｍｅ ｓｋｉｍｍｉｎｇ) 技 术ꎬ 获 得 全 基 因 组 本ꎬ表明植物野外科考调查除标本和种子收集以
(ｇＤＮＡ)较低测序深度的基因组数据ꎬ便能组装出 外ꎬ还应留有硅胶干燥的分子材料ꎮ
完整的质体全基因组、线粒体全基因组和部分核 目前ꎬＮＧＳ 平台的读长为 ３５ ~ ７００ ｂｐꎬ尽管这
基因序列ꎮ ３ 套基因组组装效率差异主要是由于 比 Ｓａｎｇｅｒ 测序长度要短ꎬ但足以用于质体基因组
植物细胞中包含了大量质体ꎬ单个细胞的质体基 的从头组装ꎮ ＮＧＳ 测序通常选择短片段测序或双
因组数量超过核基因组的 １００ 倍ꎬ因此使用相对 端测序ꎬ即 ２ × １５０ ｂｐꎮ 测序时应注意ꎬ质体片段
较低的测序深度便可获得足够的数据来组装质体 的覆盖度(ｃｏｖｅｒａｇｅ) 应大于 ３０ｘꎬ但覆盖度并非越
全基因组(Ｓｔｒａｕｂ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１２)ꎮ 全基因组浅层测 大越 好ꎬ １００ｘ ~ ２００ｘ 为 最 佳 ( Ｔｗｙｆｏｒｄ ＆ Ｎｅｓｓꎬ
序因无需事先富集或者分离纯化质体ꎬ可直接使 ２０１７)ꎮ 测序后的数据大于 ５００ Ｍｂ 就足以组装出
用较低测序深度(０.１ｘ ~ １０ｘ) 的优点ꎬ被认为是目 质体全基因组ꎬ但根据类群的质体基因组大小和
前获 得 质 体 基 因 组 最 直 接 且 成 本 最 低 的 方 法 结构复杂性的区别ꎬ一般需要 ２ ~ ５ Ｇｂ 数据ꎬ除能
(Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈꎬ ２０１５ꎻ Ｔｗｙｆｏｒｄ ＆ Ｎｅｓｓꎬ ２０１７)ꎮ 相比 提取出质体基因组以外ꎬ还能组装 ｎｒＤＮＡ 和线粒
较之下ꎬ尽管质体分离纯化富集法易从头组装ꎬ但 体基因(Ｔｗｙｆｏｒｄ ＆ Ｎｅｓｓꎬ ２０１７)ꎮ 对于个别复杂类
因其耗时、耗力、耗钱且仅能获得质体基因组而被 群ꎬ如寄生植物质体拷贝数低或 ＧＣ 含量异常ꎬ卷
淘汰ꎮ 柏科质体基因组存在同向重复( ｄｉｒｅｃｔ ｒｅｐｅａｔꎬ ＤＲ)
ＮＧＳ 文库核心步骤为基因组打断－末端修复－ 结构和重排ꎬ可考虑长片段测序或结合三代测序
加接头－ＰＣＲ￣测序前信号放大ꎬ根据是否进行 ＰＣＲ 技术ꎬ这能有效克服质体全基因组重复和结构变
可以分为 ２ 类ꎬ依赖 ＰＣＲ 的 ＮＧＳ 文库和 ＰＣＲ￣ｆｒｅｅ 异等问题( Ｂｌｅｉｄｏｒｎꎬ ２０１６ꎻ Ｈｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１)ꎮ 不
的 ＮＧＳ 文库ꎮ 尽管后者因避免扩增错误和偏向 过ꎬ三代测序仪较高的错误率和成本较高且通量
性ꎬ以及高保真性和高数据利用率而备受研究人 较低ꎬ使其不能完全取代第二代测序平台ꎮ 因此ꎬ
员的青睐ꎬ但必需的起始 ＤＮＡ 量是前者的 １００ 倍 质体基因组结构复杂类群的研究需要组合二代和
(为 １ ｕｇ ＤＮＡ)ꎮ 常用的建库试剂盒有用酶切法的 三代的测序方法ꎮ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＤＮＡ Ｐｒｅｐ、片段化的 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＴｒｕＳｅｑ、兼容 ２.２ 植物质体基因组组装策略和方法
型的 ＮＥＢ Ｕｌｔｒａ 和磁珠型 ＤＮＡ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｂｅａｄｓꎮ 维 基因组组装策略和方法的选取直接影响质体
管植物的质体基因组大小和测序的组织类型存在 基因组数据的完整性和准确性ꎬ而组装策略的选
差异ꎬ其 ｇＤＮＡ 中所含的质体基因片段含量浮动巨 择不仅要与其测序方法相匹配ꎬ而且还应考虑测

大ꎬ从 ０.３％[欧洲云杉( Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ)] 到接近 ４０％ 序质量的好坏、质体结构的复杂多变、组装结果的
[叙 利 亚 马 利 筋 ( Ａｓｃｌｅｐｉａｓ ｓｙｒｉａｃａ)] ( Ｔｗｙｆｏｒｄ ＆ 片段化、不同细胞器片段错配等问题ꎮ 二代测序
Ｎｅｓｓꎬ ２０１７)ꎮ 因此ꎬ开发一种具有广泛高兼容性 的数据多为短片段测序ꎬ对应的组装策略可分为
的试剂盒ꎬ使其提取所需数量的质体基因组片段 有参组装( ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ￣ｇｕｉｄｅｄ ａｓｓｅｍｂｌｙ) 和从头组装

进行测序是非常有必要的ꎮ (ｄｅ ｎｏｖｏ ａｓｓｅｍｂｌｙ)２ 种ꎮ 有参组装将测序数据映
标本材料的 ＤＮＡ 由于储藏时间、组织特性、干 射到参考质体基因组序列获得一致性序列为组装

燥条件等因素的影响ꎬ标本 ＤＮＡ 高度降解的 ＤＮＡ 结果ꎬ通常需要较少的计算时间和虚拟内存ꎬ适合
提取浓度低ꎬ并且易受外源 ＤＮＡ 污染ꎬ因此标本 于已有近缘参考基因组的类群组装( 常为同属植
的质体全基因组不易获得ꎮ Ｚｅｎｇ 等 (２０１８) 开发 物)ꎮ 但是ꎬ若无参考质体基因组ꎬ或是质体基因
了适合馆藏标本材料的基因组浅层测序的实用流 组结构变异较大的类群ꎬ又或是质体基因大量缺
程ꎬ仅以 ５００ ｐｇ 的起始 ＤＮＡ 量ꎬ通过模板分子不 失的类群ꎬ如果采用有参组装就会产生很多错配ꎬ
打断、不作片段选择、不少于 ８ 个 ＰＣＲ 循环富集 只有采用从头组装才能获得准确的组装结果ꎮ 优