Page 149 - 《广西植物》2025年第4期

４ 期 刘夔等: 基于 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 的钟花樱与近缘种的聚类分析及嫁接亲和性研究 ７ ６ ３

与野生种质有效分离ꎻ周成城等(２０２０) 和刘丽丽 (１０２° Ｅ、２５° Ｎ)、上海(１２１°０４′ Ｅ、３１°０２′ Ｎ)、浙
等(２０２４)利用 ＩＳＳＲ 标记分别对 １２ 份樱花种质和 江(１２０°５５′—１２２°１６′ Ｅ、２８°５１′—３０°３３′ Ｎ) 等地
１８ 份樱属材料进行了亲缘关系分析ꎬ发现 ＩＳＳＲ 标 搜集了 １６ 份樱花种质资源ꎬ具体见表 １ꎮ 本课题
记在樱属种具有较高的遗传多样性ꎬ能够较好地 组主要进行中国樱花种质资源调查、物种分类和
用于 樱 属 植 物 间 的 亲 缘 关 系 分 析ꎻ 赵 庆 杰 等 育种等方面的工作ꎬ野外对已经长出叶片的樱花
(２０１６)利用 ＳＣＡＲ 分子标记成功地对 ２０ 个樱花 采集健康、无病害的幼叶若干后用硅胶处理ꎬ运回
品种进行了鉴定ꎻ严佳文等(２０２２) 利用 ＳＮＰ 标记 实验室 ４ ℃ 冰箱保存ꎬ而对于另一部分还未长出
技术对 ４７ 份樱花种质进行了遗传多样性分析ꎬ能 叶片的樱花ꎬ野外采集其枝条或实生苗ꎬ运回后对
够对樱花杂交后代进行有效区分和未知类群的鉴 其枝条进行水培或扦插以及对实生苗进行种植ꎬ

定ꎻ何恒流等(２０１５) 利用 ＳＳＲ 分子标记对陕西 ７ 精心管理后待长出嫩叶ꎬ采集健康、无病害的幼叶
个毛樱桃自然居群进行遗传多样性分析ꎬ结果表 若干ꎬ采后立即送回实验室－８０ ℃ 保存ꎬ用于分子
明陕西毛樱桃自然居群遗传多样性水平较高ꎻ宗 试验ꎮ 种植成活的幼苗移植到试验基地ꎬ以利于
宇等(２０１６)利用 ＳＳＲ 分子标记对 ２４ 份樱桃种质 种质资源的保存ꎬ也为后续的育种工作留下宝贵
进行聚类结果ꎬ但与经典的形态学分类不完全一 的试验材料ꎮ
致ꎻ李水根等(２０２２) 利用基因组 ＳＳＲ 分子标记可 １.２ ＥＳＴ 序列来源
以较好地反映 ４５ 种供试樱属植物之间的亲缘关 从 ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｇｅｎｂａｎｋ 下载
系ꎻ孙泽硕等(２０２３)利用 ＳＳＲ 标记对 ４２ 份樱花品 樱属植 物 的 ＥＳＴ 序 列ꎬ 并 且 通 过 搜 索 字 段 输 入
种进行了聚类分析和 ＤＮＡ 指纹图谱构建ꎬ但对部 Ｃｅｒａｓｕｓ 总共获得 １１１ ８５０ 个 ＥＳＴ 序列ꎬ选择其中
分混合品种不能很好地聚类区分ꎮ 然而ꎬ目前利 部分单序列进行 ＳＳＲ 信息分析和 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物
用 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 对我国樱属植物原种进行遗传多样性 开发ꎮ
和亲缘关系分析的相关研究还鲜见报道ꎮ １.３ ＥＳＴ￣ＳＳＲ 的查找
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 分子标记技术属于第二代分子标记 登 录 网 址 ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｇｒａｍｅｎｅ. ｏｒｇ / ｇｒｅｍｅｎｅ /
技术ꎬ其稳定性、多态性和安全性都要高于 ＲＦＬＰ、 ｓｅａｒｃｈｅｓ/ ｓｓｒｔｏｏｌꎬ我们使用 ＳＳＲＩＴ 软件在线搜索了
ＲＡＰＤ、ＡＦＬＰ 等分子标记技术ꎬ可很好地用于物种 二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核
间的遗传多样性和亲缘关系分析ꎮ 本研究以钟花 苷酸 ５ 种类型的 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 序列ꎬ其中重复序列长
樱及其近缘种等 １６ 种樱属植物为研究对象ꎬ采用 度必须大于 １５ ｂｐ 的识别标准ꎬ即重复次数应分别
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 分子标记对钟花樱及其近缘种进行亲缘 大于或等于 １０、６、５、３、３ꎮ
关系的探讨ꎬ通过遗传多样性分析和聚类分析ꎬ拟 １.４ ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物设计
探讨以下问题:(１) 钟花樱及其近缘种等 １６ 种樱 利用 Ｐｒｉｍｅｒ ５.０ 软件设计 ＳＳＲ 侧翼区的引物ꎮ
属植物遗传多样性的高低ꎻ(２) 钟花樱与其余 １５ 引物设计的主要参数如下:ＥＳＴ 序列长度必须大
种樱属植物亲缘关系的远近ꎻ(３) 能否筛选出与钟 于 １００ ｂｐꎻＳＳＲ 序列的起始和终止位置应分别与
花樱亲缘关系较远的近缘种ꎬ用于杂交育种选育 ５′和 ３′相距不小于 ２０ ｂｐꎻ引物长度为 １８ ~ ２２ ｂｐꎻ
优良新品种ꎻ(４)能否筛选出与钟花樱亲缘关系较 退火温度 Ｔｍ 值为 ５０ ~ ６５ ℃ ꎻ上游和下游引物的
近的近缘种ꎬ用于培育优良砧木ꎮ 以期为进一步 Ｔｍ 值 均 应 小 于 ５ ℃ ꎻ ＰＣＲ 扩 增 产 物 的 长 度 为
研究钟花樱及其近缘种的物种分类、物种资源保 １００ ~ ５００ ｂｐꎬ当分数超过 ９０ 分时可以用于引物合
护利用、杂交亲本选择和砧木的选择等提供分子 成ꎻ此外ꎬ引物的二级结构应尽量避免出现ꎮ 引物

水平依据和技术支持ꎮ 设计完成后ꎬ由上海桑尼生物科技有限公司合成ꎬ
命名为 ＰＣ 加序列号ꎬ如 ＰＣ１ꎮ 选择表型性状差异
１ 材料与方法 较大的 ４ 种材料( 散毛樱、郁李、钟花樱、黑樱桃)

进行引物筛选ꎮ
１.１ 材料 １.５ 总 ＤＮＡ 提取
２０２１ 年 ３—４ 月 本 课 题 组 成 员 先 后 从 福 建 采用植物 / 真菌基因组 ＤＮＡ 小量提取试剂盒
(１１７°２４′—１１８° ０２′ Ｅ、２７° ３２′—２７° ５５′ Ｎ)、 云 南 (上海莱枫生物科技有限公司)进行 ＤＮＡ 的提取ꎬ