Page 116 - 《广西植物》2025年第5期

９ ２ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
数量、碱基数量、ＧＣ 含量、碱基质量ꎮ 利用 ＳＴＡＲ 表 １ ｑＲＴ￣ＰＣＲ 引物列表
ｖ２.５.０ 将 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 与全长转录本进行序列比对ꎬ Ｔａｂｌｅ １ Ｌｉｓｔ ｏｆ ｑＲＴ￣ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ
获 取 其 在 转 录 本 上 的 位 置 信 息ꎮ 使 用 Ｋａｌｌｉｓｔｏ 引物名称 引物序列 (５′￣３′)
ｖ０.４６.１ 将 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａ 与全长转录本进行比对并直 Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′)
１８Ｓ ｒＲＮＡ￣ｑＦ ＧＧＧＣＡＴＴＣＧＴＡＴＴＴＣＡＴＡＧＴＣＡＧＡＧ
接 计 数ꎬ 采 用 ＦＰＫＭ ( ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｐｅｒ ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ ｍｉｌｌｉｏｎ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｍａｐｐｅｄ) 作为衡量基 １８Ｓ ｒＲＮＡ￣ｑＲ ＣＧＧＴＴＣＴＴＧＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＣＡＴＣＣＴ
因表达水平的指标ꎮ 利用 ＤＥＳｅｑ ｖ１.６.３ 筛选不同 Ｅｎ１０８９５０￣ｑＦ ＡＴＧＴＣＣＴＴＧＴＧＧＧＡＧＧＡＧＧＡ
样品 间 ( 处 理 组 ＶＳ 对 照 组) 的 差 异 表 达 基 因 Ｅｎ１０８９５０￣ｑＲ ＣＣＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＡ
(ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｇｅｎｅｓꎬ ＤＥＧｓ)ꎬ 差 异 倍 数 Ｅｎ３５５７３￣ｑＦ ＡＣＴＣＧＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＴＴＧＣＴ

(ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅꎬ ＦＣ)表示 ２ 个样品间表达量的比值ꎬ Ｅｎ３５５７３￣ｑＲ ＣＡＴＧＧＧＧＡＡＧＡＡＣＧＡＣＴＴＧＡ
使用 ｌｏｇ ＦＣ 值筛选不同激素处理后 ＥｎＴＣＰｓ 中的 Ｅｎ１０３４７￣ｑＦ ＡＣＣＴＣＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣ
２
ＤＥＧｓꎬ将 ｜ Ｌｏｇ ＦＣ ｜ ≥１.５０ 且 Ｐ<０.０１ 作为筛选标 Ｅｎ１０３４７￣ｑＲ ＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＡＴＧＧＡＣＴＧＧＡ
２
准ꎮ 并利用 ＴＢｔｏｏｌｓ ｖ２.０４２ 绘制热图ꎮ Ｅｎ１６３２５￣ｑＦ ＣＡＣＡＧＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣＴＣＧＣＣ
通过实时荧光定量 ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) 检测激素 Ｅｎ１６３２５￣ｑＲ ＴＴＣＴＧＧＡＣＣＡＣＧＧＴＡＧＡＧＧＣ
响应的关键 ＥｎＴＣＰ 基因的相对表达量ꎮ 具体流程 Ｅｎ１２８７９０￣ｑＦ ＣＡＴＧＴＴＣＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＣ
如下:使用 ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ 试剂盒[天根生 Ｅｎ１２８７９０￣ｑＲ ＴＧＧＴＡＧＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＧＣＡＣ
化科技( 北京) 有限公司ꎬ中国] 提 取 ＲＮＡꎬ利 用 Ｅｎ１０３４６￣ｑＦ ＣＡＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＡＴＣＣＡＧＧＴ
ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ￣１０００ ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ
Ｅｎ１０３４６￣ｑＲ ＣＴＴＧＴＴＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＴＴＣ
ＷａｌｔｈａｍꎬＭＡꎬＵＳＡ)评估 ＲＮＡ 纯度ꎻ使用 ５×Ａｌｌ￣Ｉｎ￣
Ｅｎ１４０２８￣ｑＦ ＧＣＧＧＣＣＡＣＡＴＣＧＧＧＴＴ
Ｏｎｅ ＲＴ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ 试 剂 盒 ( ｗｉｔｈ ＡｃｃｕＲＴ Ｇｅｎｏｍｉｃ
Ｅｎ１４０２８￣ｑＲ ＣＧＣＣＧＡＣＣＴＧＡＴＧＧＴＡＧＡＡＣ
ＤＮＡ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ) ( Ｃａｔ. Ｎｏ. Ｇ４９２) 进行反转录ꎬ获
得 ｃＤＮＡꎮ 利 用 在 线 软 件 Ｐｒｉｍｅｒ ３ ( ｈｔｔｐｓ: / /
ｂｉｏｉｎｆｏ.ｕｔ.ｅｅ / ｐｒｉｍｅｒ３￣０.４.０ / ) 设计特异性引物( 表 盖的基因使用蓝色标注ꎬ占比为７１.５％ꎬ结果表明
去冗余后的转录本比对上已知基因集的基因较
１)ꎬ 以 １８Ｓ ｒＲＮＡ 作 为 内 参 基 因ꎬ 使 用 Ｆａｓｔ Ｓｔａｒｔ
Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ( ＲＯＸ) 试剂配制 多ꎬ转录本完整性较好ꎬ可用于后续分析ꎮ 全长转
２０ μＬ 反应体系在 Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７５００ ＰＣＲ 仪 录组数据上传至国家基因组科学数据中心ꎬＧＳＡ
上进行 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 实验ꎮ 每种反应设置 ３ 个重复ꎬ 编号为 ＣＲＡ００６８６７ꎮ
２.２ 全长转录本 ＣＤＳ 预测
－ΔΔＣｔ
实验结果使用 ２ 方法计算基因的相对表达量ꎬ
通过对去冗余转录本序列的 ＣＤＳ 区域及其对
利用 ＩＢＭ ＳＰＳＳ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ２０.０ 进行统计分析ꎮ
应氨基酸序列进行预测ꎬ共获得开放阅读框( ｏｐｅｎ
２ 结果与分析 ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ)８１ ７８２ 个ꎬ其中完整开放阅读
框 ３９ １５７ 个ꎮ ＣＤＳ 编码的蛋白序列长度分布如图

２.１ 全长转录组测序结果统计 ２ 所示ꎬ蛋白序列最长达 １ ８００ ~ １ ９００ ａａꎬ整体趋
在 ＰａｃＢｉｏ 平台进行垂穗披碱草全长转录组测 势为蛋白序列越长ꎬ数量越少ꎮ
序ꎬ共获得全长转录组数据 ３６.９６ Ｇｂꎮ 原始数据 ２.３ 全长转录本功能注释
经过纠错和合并后得到 ３５１ ７８７ 条 ＣＣＳꎬＣＣＳ 序列 将全长转录本序列在 ８ 个数据库中进行功能
平均长度为 １ ７１９ ｂｐꎻＣＣＳ 序列经过校正和聚类后 注释ꎬ结果(表 ２)显示ꎬ共有 ８０ ４２１ 条转录本被注
得到 ２７８ ０７６ 条全长非嵌合序列ꎻ对全长非嵌合序 释ꎬ占 总 转 录 本 数 量 的 ８８. ４２％ꎬ 其 中 Ｎｒ、 Ｓｗｉｓｓ￣
列进行聚类后得到 １３１ ２２４ 条高质量一致序列ꎬ对 Ｐｒｏｔ、Ｐｆａｍ、ＧＯ、ＫＯＧ、ＣＯＧ、ｅｇｇＮＯＧ 和 ＫＥＧＧ 数据

高质量一致序列合并进行去冗余分析得到 ９０ ９５６ 库 分 别 注 释 了 ７８ １５５ ( ９７. １８％)、 ５１ ６８９
条非冗余转录本ꎮ 去冗余后的转录本基于通用单 (６４.２７％)、 ５４ ０４４(６７.２０％)、６２ ３５５(７７.５０％)、
拷贝同源基因( ｂｅｎｃｈｍａｒｋｉｎｇ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｓｉｎｇｌｅ￣ｃｏｐｙ ３９ ９６４ ( ４９. ６９％)、 ２３ ３２３ ( ２９. ００％)、 ６４ ５３８
ｏｒｔｈｏｌｏｇｓꎬ ＢＵＳＣＯｓ) 评估其完整性(图 １)ꎬ 完全覆 (８０.２５％) 和 ５０ ９０２(６３.２９％)条全长转录本ꎮ 在