Page 115 - 《广西植物》2025年第5期
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５ 期 彭晓梅等: 垂穗披碱草 ＴＣＰ 转录因子家族鉴定及激素响应模式分析 ９ １ ９
书指示进行操作ꎮ 将提取的总 ＲＮＡ 进行质量检 Ｇｅｎｏｍｅｓ)数据库进行 ＢＬＡＳＴ 比对分析ꎬ获取转录
测: 使 用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ￣１０００ ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ 本注释信息ꎬ同时评估垂穗披碱草与其他物种基
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ Ｗａｌｔｈａｍꎬ ＭＡꎬ ＵＳＡ)评估 ＲＮＡ 纯度ꎻ使 因序列的相似性ꎮ
用 Ａｇｉｌｅｎｔ Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ ( Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬ １.６ ＴＣＰ 转录因子家族成员的鉴 定 及 理 化 性 质
Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ) 的 ＲＮＡ Ｎａｎｏ ６０００ Ａｓｓａｙ 分析
Ｋｉｔ 试剂盒评估 ＲＮＡ 质量ꎮ 将检测合格的总 ＲＮＡ 从 ＰＦＡＭ 数据库(ｈｔｔｐ: / / ｐｆａｍ.ｘｆａｍ.ｏｒｇ / ) 下载
样品进行文库构建ꎮ ＴＣＰ 转录因子家族保守结构域的隐马尔可夫模型
１.３ 文库构建、Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序和 ＳＭＲＴ 测序 文件(ＰＦ０３６３４)ꎬ通过 ＨＭＭＥＲ ３.０ 软件在垂穗披
ＲＮＡ 样品质量检测合格后ꎬ使用 ＴｒｕＳｅｑ ＲＮＡ 碱草全长转录组蛋白序列中初步筛选 ＴＣＰ 转录因
ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ (Ｉｌｌｕｍｉｎａꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ) 构建 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 子家族成员ꎻ将筛选到的 ＴＣＰ 转录因子家族成员
测序文库ꎻ将 ２７ 个样品的 ＲＮＡ 等质量混样后ꎬ使 进 一 步 使 用 ＰＦＡＭ、 ＳＭＡＲＴ 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / /
用 ＳＭＲＴｂｅｌｌ Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ(Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ ｓｍａｒｔ. ｅｍｂｌ￣ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ. ｄｅ / ) 和 ＮＣＢＩ ＣＤＤ 数 据 库
Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ) 构建 ＳＭＲＴ 测序文库ꎮ 文 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ / ｂｗｒｐｓｂ /
库经质检合格后进行测序ꎬ测序方法参照操作手 ｂｗｒｐｓｂ.ｃｇｉ)进行序列比对和确认ꎬ舍弃重复、冗余
册进行ꎮ 以上文库构建及测序工作由百迈客生物 和注释不完整的序列ꎬ保留下来的序列即为垂穗
科技有限公司完成ꎮ 披碱草 ＴＣＰ 转录因子家族成员ꎮ 利用在线软件
１.４ 全长转录组测序数据质量控制 ＥｘＰＡＳｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
使用 ＳＭＲＴ Ｌｉｎｋ ｖ１０.１ 软件中的 ＩｓｏＳｅｑ 模块 ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )分析 ＴＣＰ 蛋白一级结构的理化性质ꎬ
对全长转录组原始测序数据进行预处理和过滤ꎬ 包括氨基酸数量、分子量(ｍｏｃｕｌａｒ ｗｅｉｇｈｔꎬ ＭＷ) 以
按默认参数设置ꎬ统计以下项目:环形一致性序列 及 等 电 点 ( ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ ｐｏｉｎｔꎬ ｐＩ )ꎮ 利 用 ＴａｒｇｅｔＰ
(ｃｉｒｃｕｌａｒ ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ＣＣＳ) 的数量、全长 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/
非嵌合序列( ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｎｏｎ￣ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｒｅａｄｓꎬ ＦＬＮＣ) ＴａｒｇｅｔＰ￣２.０ / )对 ＴＣＰ 蛋白进行亚细胞定位预测ꎬ
的数量及平均长度、聚类分析后得到高质量一致 同 时 使 用 在 线 软 件 ＣＥＬＬＯ ( ｈｔｔｐ: / / ｃｅｌｌｏ. ｌｉｆｅ.
性序列的数量ꎮ 利用 ＣＤ￣ＨＩＴ ｖ４.６.１ 通过序列比 ｎｃｔｕ.ｅｄｕ.ｔｗ / )对预测结果进行二次确认ꎬ确保预测
对聚类 法 去 除 冗 余ꎬ 参 数 设 置 如 下:￣ｃ ０. ９５ ￣ａＳ 结果的可信度ꎮ
０.９５ ￣ａＬ ０.９５ ￣ＡＳ ６０ ￣ＡＬ ６０ꎻ最终输出 １ 个非冗余 １.７ ＥｎＴＣＰｓ 系统进化及保守基序分析
的序列文件ꎬ去冗余后的基因即为 Ｕｎｉｇｅｎｅｓꎮ 利用 通过 ＰｌａｎｔＴＦＤＢ 植物转录因子数据库(ｈｔｔｐ: / /
ＢＵＳＣＯ ｖ３.０.２ 将 ＯｒｔｈｏＤＢ 作为参考数据库ꎬ将去 ｐｌａｎｔｔｆｄｂ.ｇａｏ￣ｌａｂ.ｏｒｇ / )下载模式植物拟南芥和水稻
冗余后的转录本比对到近源物种的基因集ꎬ对去 的 ＴＣＰ 转 录 因 子 家 族 成 员 的 蛋 白 序 列ꎻ 利 用
冗 余 后 的 转 录 组 进 行 完 整 性 评 估ꎮ 使 用 ＭＥＧＡ Ｘ 软件的 ＣｌｕｓｔａｌＷ 模块对拟南芥、水稻和垂
ＴｒａｎｓＤｅｃｏｄｅｒ ｖ５.０.０ 对去冗余转录本的编码区序 穗披碱草 ＴＣＰ 蛋白进行多序列比对ꎬ使用邻接法
列(ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ＣＤＳ)及其对应氨基酸序列进 (ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄꎬ ＮＪ) 构 建 垂 穗 披 碱 草
行预测ꎮ ＴＣＰ 转 录 因 子 家 族 的 系 统 进 化 树ꎬ 自 展 值
１.５ 全长转录本功能注释 (ｂｏｏｔｓｔｒａｐｓ) 设 置 为 １ ０００ꎻ 利 用 在 线 软 件 ｉＴＯＬ
将非 冗 余 全 长 转 录 本 在 Ｎｒ ( ＮＣＢＩ Ｎｏｎ￣ (ｈｔｔｐｓ: / / ｉｔｏｌ.ｅｍｂｌ.ｄｅ / ) 美化进化树ꎮ 使用在线软
Ｒｅｄｕｎｄａｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ)、 Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ 件 ＭＥＭＥ( ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ. ｏｒｇ / ) 分析 ＴＣＰ 蛋白
( Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ )、 Ｐｆａｍ 保 守 Ｍｏｔｉｆꎬ 参 数 设 置 如 下: ａｎｙ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
( Ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ )、 ＧＯ ( Ｇｅｎｅ Ｏｎｔｏｌｏｇｙ )、 ＫＯＧ Ｒｅｐｅｔｉｔｉｏｎｓ( ａｎｒ)ꎬ ｍａｘｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ Ｍｏｔｉｆｓ ＝ １０ꎬ
( Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ ｆｏｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｍｉｎｉｍｕｍ ｗｉｄｔｈ≥６ꎬ ａｎｄ ｍａｘｉｍｕｍ ｗｉｄｔｈ≤５０ꎮ
Ｃｏｍｐｌｅｔｅ Ｇｅｎｏｍｅｓ)、 ＣＯＧ ( Ｃｌｕｓｔｅｒｓ ｏｆ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ １.８ 二代转录组测序数据质量控制及 ＥｎＴＣＰｓ 表
Ｇｒｏｕｐｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ)、ｅｇｇＮＯＧ(Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ Ｇｅｎｅａｌｏｇｙ 达量分析
ｏｆ Ｇｅｎｅｓ: Ｎｏｎ￣ｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ Ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ Ｇｒｏｕｐｓ 对 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序平 台 获 得 的 ２７ 份 原 始 数 据
Ｄａｔａｂａｓｅ)、ＫＥＧＧ( Ｋｙｏｔｏ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ (ｒａｗ ｄａｔａ) 进行过滤得到 Ｃｌｅａｎ ｄａｔａꎬ并统计 Ｒｅａｄ
