Page 147 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 王嘉琪等: 冬枣 ｃＤＮＡ 三框表达文库构建及 ＺｊＲＷＤ４０ 基因上游调控因子的筛选 １ ３ ３ ９

板ꎬ回收扩增菌落并提取质粒ꎬ取 １ μＬ 电泳检测 库 质 粒ꎬ 使 用 Ｙｅａｓｔｍａｋｅｒ 酵 母 转 化 酶 试 剂 盒
扩增文库质粒效果ꎬ保留 ４０ ｍＬ 扩增文库甘油菌ꎮ (Ｔａｋａｒａꎬ宝日医生物技术有限公司)将质粒转化到
１.２.３ 冬枣 ＺｊＲＷＤ４０ 基因家族顺式作用元件预测 Ｙ１ＨＧｏｌｄ￣Ｂａｉｔ 酵母菌中ꎬ分别获得 １５ ｍＬ 悬浮菌
从拟南芥数据库获取 ＡｔＲＷＤ４０ 基因序列ꎬ通过 液ꎮ 分别取少量悬浮液进行 １ / １０、１ / １００ 稀释ꎬ涂

ＮＣＢＩ 获得枣的全基因组和基因组结构注释文件ꎬ １００ μＬ 至 １００ ｍｍ 的监控平板 ＳＤ / ￣Ｌｅｕꎬ计算筛选
利用 ＴＢｔｏｏｌｓ 进行序列比对ꎬ得到冬枣 ＺｊＲＷＤ４０ 基 克隆的总量ꎮ 将剩余悬浮液涂布 ５０ 个 １５０ ｍｍ 的
因家族ꎮ 提取冬枣 ＺｊＲＷＤ４０ 基因家族转录起始位 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ / ＡｂＡ (３００ ｎｇｍＬ ) 平板ꎬ３０ ℃ 培养 ５
￣１
点上游 １ ５００ ｂｐ 启动子区序列ꎬＰｌａｎｔ ＣＡＲＥ 预测 ｄꎮ 对 ２ 个筛选平板中正常生长的菌落转移至新
￣１
ＺｊＲＷＤ４０ 基因家族启动子顺式作用元件ꎬ选择 ３ 的 ＳＤ / ￣Ｌｅｕ / ＡｂＡ (３００ ｎｇｍＬ ) 平板上ꎬ进一步
个与胁 迫 相 关 的 顺 式 作 用 元 件 做 诱 饵 序 列ꎬ 即 培养确认ꎮ

Ｂａｉｔ１、Ｂａｉｔ２ 和 Ｂａｉｔ３ꎬ用于后续酵母单杂交分析ꎮ １.２.６ 阳性克隆测序及候选蛋白功能分析 挑取
１.２.４ Ｂａｉｔ 酵母菌株构建及最低 ＡｂＡ 抗性检测 阳性克隆菌落进行菌液 ＰＣＲꎬ电泳检测产物条带
分别将 ３ 个 Ｂａｉｔ 序列前后各扩增 ２ 个碱基ꎬ进行 ３ 大小ꎬ回收特异条带ꎬ个别样品回收 ２ 条主带进行
次串联重复ꎬ构建到 ｐＡｂＡｉ 质粒 Ｓａｃ Ｉ / Ｓａｌ Ｉ 位点 测序ꎬ将结果在 ＮＣＢＩ 进行 ＢＬＡＳＴｎ 比对ꎬ去掉无
间ꎬ电泳检测连接效果ꎬ选取条带大小正确的质粒 效序列后在 ＵｎｉＰｒｏｔ 上进行功能注释( 王惠冉等ꎬ
测序ꎬ将测序正确的 Ｂａｉｔ 质粒用 Ｂｂｓ Ｉ 限制性内切 ２０２４ｂ)ꎮ
酶线性化处理ꎬ电泳检测酶切效果ꎮ 切胶纯化回
２ 结果与分析
收后ꎬ转入 Ｙ１ＨＧｏｌｄ 菌株中ꎬ涂布 ＳＤ / ￣Ｕｒａ 平板ꎬ
获得含有诱饵序列的 Ｂａｉｔ１￣ＡＢＲＥ 菌株、Ｂａｉｔ２￣ＭＢＳ
菌株和 Ｂａｉｔ３￣ＴＧＡＣＧ￣ｍｏｔｉｆ 菌株ꎮ 分别取适量菌液 ２.１ 总 ＲＮＡ 提取及 ｃＤＮＡ 合成
至 １ ｍＬ ０.９％ ＮａＣｌ 中ꎬ分光光度计测定 ＯＤ 值ꎬ 冬枣叶片和果实总 ＲＮＡ 质量良好( 图 １:Ａ)ꎬ
６００
稀释至 ＯＤ 值约为 ０.００２ꎬ取 １００ μＬ 菌液涂布含 合成的 ｃＤＮＡ 长度在 ５００ ~ ５ ０００ ｂｐ 之间( 图 １:
６００
有不同浓度金担子素 Ａ( ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｎ ＡꎬＡｂＡ) 的 Ｂ)ꎬ对合成的 ｃＤＮＡ 均一化处理和去除短片段后ꎬ
ＳＤ / ￣Ｕｒａ / ＡｂＡ 平板ꎬ检测 ３ 个菌株最低 ＡｂＡ 抗性ꎮ ｃＤＮＡ 范围缩小至 ７００ ~ ２ ５００ ｂｐ(图 １:Ｃ、Ｄ)ꎬ说
１.２.５ 酵母单杂交筛选互作蛋白 分别取 ２０ μｇ 文 明已有效去除小于 ５００ ｂｐ 杂质片段ꎮ

Ａ. 叶片和果实总 ＲＮＡꎻ Ｂ. ｃＤＮＡ 合成ꎻ Ｃ. ｃＤＮＡ 均一化ꎻ Ｄ. ｃＤＮＡ 短片段去除ꎻ Ｍ. ＤＬ５０００ Ｍａｒｋｅｒꎮ
Ａ. Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓꎻ Ｂ. ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎻ Ｃ. ｃＤＮＡ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎꎻ Ｄ. Ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃＤＮＡꎻ Ｍ. ＤＬ５０００ Ｍａｒｋｅｒ.
图 １ 冬枣叶片和果实总 ＲＮＡ 提取、ｃＤＮＡ 合成和均一化处理
Ｆｉｇ. １ ＲＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎꎬ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｈｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｒｏｍ Ｚｉｚｙｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ ｃｖ. Ｄｏｎｇｚａｏ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｆｒｕｉｔｓ

２.２ ｃＤＮＡ 文库构建与插入片段检测及质粒提取 ＰＣＲꎬ检测插入片段长度ꎮ 由图 ２ 可知ꎬ所有克隆
通过计算获得的 ３ 个读码框初级文库库容均 条带均单一ꎬ插入片段长度 ４００ ~ ２ ０００ ｂｐꎬ均长
为 １.５ × １０ ＣＦＵꎬ 随 机 挑 取 １６ 个 菌 落 进 行 菌 液 １ ０００ ｂｐꎬ重组率达 １００％ ꎬ表明构建的 ｃＤＮＡ 文库
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