Page 146 - 《广西植物》2025年第7期

１ ３ ３ ８ 广 西 植 物 ４５ 卷
大量研究证明 ＷＤ４０ 参与了干旱、盐等逆境胁迫响 ｃＤＮＡ 文 库ꎬ 而 后 运 用 酵 母 单 杂 交 技 术ꎬ 选 取
应ꎬ但目前该方面的研究仅在拟南芥( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ＺｊＲＷＤ４０ 基因家族启动子区的 ３ 个顺式作用元件
ｔｈａｌｉａｎａ)等模式植物中较深入( 华静静和陈晓静ꎬ 为诱饵ꎬ初步筛选调控 ＺｊＲＷＤ４０ 基因表达的上游
２０１５ꎻ杨述章等ꎬ２０１５)ꎮ 闫诚(２００５) 通过比较干 调控蛋白ꎬ为进一步研究 ＺｊＲＷＤ４０ 基因分子机制
旱和 ＡＢＡ 处理下突变体的叶片失水率、气孔大小 及调控冬枣果实发育提供一定参考ꎬ同时为冬枣
和密度等指标变化ꎬ证明具有 ＷＤ４０ 重复结构的 抗旱育种奠定理论基础ꎮ
ＡｔＡＲＣＡ 与 ＡｔＡＧＢ１ 均参与了干旱胁迫信号转导过
程ꎮ 在棉花中ꎬＧｈＷＤ４０ 基因超表达降低了植株对 １ 材料与方法
盐和干旱的耐受性ꎬ表明 ＧｈＷＤ４０ 参与并负调控

了拟南芥响应盐和干旱胁迫途径(李洁ꎬ２０１３)ꎮ １.１ 研究材料
在植物中ꎬＷＤ４０ 基因对于植物的生长发育具 本研究所用植物材料为 ３ 年生冬枣ꎬ以酸枣

有重要意义ꎬ例如在花青素合成、分生组织形成、 (Ｚｉｚｉｐｈｕｓ ｊｕｊｕｂａ ｖａｒ. ｓｐｉｎｏｓｅ)作为嫁接砧木ꎬ种植于
幼苗发育、花发育、光信号传递和感知等方面发挥 北方民族大学物研所(１０６°１０′ Ｅ、３８°２９′ Ｎ)ꎬ光照
作用ꎬ在植物的发育和生理过程中也起着重要作 周期 １２ ｈｄ 、光照强度 １５０ μｍｏｌｍ ｓ ꎮ 分
￣１
￣２
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用(Ｊｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０２２)ꎮ 在多刺绿绒蒿中ꎬＷＤ４０ 基因 别于 ２０２３ 年 ５ 月至 ９ 月ꎬ每隔 １０ ｄꎬ采集自然状态
启动子区存在很多逆境响应元件ꎬ表明其可能参 下冬枣叶片和果实组织材料ꎬ将采集的幼叶、老叶
与调节植物生长、发育、次生代谢物积累等( 任玉 及白熟期、半红期、全红期果实分别混样ꎬ含 ３ 个
玲等ꎬ２０２２)ꎻ在辣椒果实中ꎬＣａＭＹＢＡ 和 ＣａＷＤ４０ 生物学重复ꎬ于－８０ ℃ 冰箱备用ꎮ
基因被病毒介导的基因独立沉默ꎬ结构基因的转 １.２ 研究方法
录水平及花青素含量出现了相似的下降( Ｏｈｎｏ ｅｔ １.２.１ ｃＤＮＡ 合成与均一化 提取 ＲＮＡ 约 １ μｇꎬ使
ａｌ.ꎬ２０２０)ꎻ在 番 茄 中ꎬＷＤ４０ 家 族 基 因 ＳｌＷＤＲ２０４ 用 ＳＭＡＲＴ 法进行 ｃＤＮＡ 第一链合成ꎬ经过 ＰＣＲ 扩
过表达转基因植株茎秆长度增长( 张琳等ꎬ２０２１)ꎮ 增得到双链 ｃＤＮＡꎬ取 ５ μＬ ｃＤＮＡ 进行 １.５％ 琼脂
邵凤清等(２０２３) 研究了关于 ＤＮＡ 甲基化调控果 糖凝胶 电 泳ꎬ检 测 ｃＤＮＡ 合 成 效 果ꎬ对 纯 化 后 的
实发育及成熟的作用机制ꎬＬｉｕ 等(２０２１) 研究发现 ｃＤＮＡ 进行均一化处理ꎬ随后进行 ＰＣＲ 扩增并电
了拟南芥 ＷＤ４０ 复合体ꎬ其中 ＲＷＤ４０ 起到了连接 泳检测ꎬ获得均一化 ｃＤＮＡꎮ 利用限制性内切酶
ＲＯＳ１ 与其他蛋白的关键作用ꎬＷＤ４０ 蛋白能够感 Ｓｆｉ Ｉ酶切处理 ｃＤＮＡ 后使用凝胶过滤树脂填充的
知组蛋白修饰的变化ꎬ并将信号传递给 ＤＮＡ 甲基 离心柱(缓冲液:Ｔｒｉｓ￣ＥＤＴＡ Ｂｕｆｆｅｒ) 进行过柱处理ꎬ
化相关蛋白ꎬ从而触发相应的 ＤＮＡ 甲基化或去甲 去除短片段ꎬ再用酚、氯仿、异戊醇( ２５ ∶ ２４ ∶ １ꎬ
基化反应( Ｖａｌｅｎｔｉｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２)ꎮ 当组 蛋 白 Ｈ３ Ｖ / Ｖ / Ｖ)处理( 张琨等ꎬ２０２３)ꎬｄｄＨ Ｏ 溶解获得去
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的赖氨酸残基发生甲基化修饰时ꎬＷＤ４０ 蛋白可能 除短片段的 ｃＤＮＡꎬ取 １ μＬ ｃＤＮＡ 电泳检测去除
识别这种修饰ꎬ并促使与之结合的 ＤＮＡ 甲基转移 效果ꎮ
酶或去甲基化酶发挥作用ꎬ调整 ＤＮＡ 甲 基 化 水 １.２. ２ ｃＤＮＡ 文 库 构 建 及 质 粒 提 取 将 过 柱 后
平ꎬ进而影响基因的表达和植物的生长发育( 张淼 ｃＤＮＡ 和 ｐＧＡＤＴ７ 三框载体于 １２ ℃ 条件下过夜连
等ꎬ２０２２)ꎮ 因此ꎬ研究 ＲＷＤ４０ 基因分子调节机制 接ꎬ并纯化连接液ꎬ获得初级 ｃＤＮＡ 文库ꎮ 取 １ μＬ
对于冬枣响应干旱胁迫及参与 ＤＮＡ 甲基化调控 连接液于 １.８ ｋＶ、２００ Ω、２５ μＦ 条件下电转化感受

具有重要意义ꎮ 态细胞 ＨＳＴ０８ꎬ取适量转化液涂布于含有氨苄青
目前ꎬ已有许多研究表明表观遗传调控果实 霉素(ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬ Ａｍｐ)抗性的 ＬＢ 平板ꎬ３７ ℃ 过夜
成熟的作用机制ꎬ但关于冬枣的 ＤＮＡ 甲基化对其 培养ꎬ统计菌落数量ꎬ检测初级文库库容ꎬ初级文

生长发育调控机制研究较少ꎬ另外ꎬ针对 ＲＷＤ４０ 库库容 ＝ 平板菌落数 / １０ μＬ×稀释倍数(１００ 倍) ×
基因在干旱胁迫下如何影响冬枣 ＤＮＡ 甲基化的 连接 液 总 体 积 ( ｍＬ)ꎬ 再 随 机 挑 取 菌 落ꎬ 利 用
具体分子机制研究相对较少ꎬ还需要进一步研究 ｐＧＡＤＴ７ 引物进行菌液 ＰＣＲ 检 测 插 入 片 段 长 度
揭示其在干旱胁迫响应中的具体作用机制和生物 (张琨ꎬ２０２２)ꎮ 初级 ｃＤＮＡ 三框表达文库连接液
学功能ꎮ 本研究首先构建了冬枣叶片和果实全长 混合后电转化至感受态细胞 ＨＳＴ０８ꎬ涂布 ＬＢ 平