Page 16 - 《广西植物》2025年第7期
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１ ２ ０ ８ 广 西 植 物 ４５ 卷
ＭＩＮＬ)ꎮ 大豆 耐 荫 指 数 ( ＳＴＩ) 计 算 公 式 为 ＳＴＩ ＝ ５ ｓꎬ６０ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ共 ４０ 个循环ꎬ５０ ℃ ３０ ｓꎬ终止
(ＰＨ ＋ ＭＩＮＬ ) / ２ꎬ其中 ＰＨ 和 ＭＩＮＬ 分别为株高和 反应ꎮ 根据相对定量中 ２ －ΔΔＣｔ 法计算相对表达量
ｒ
ｒ
ｒ
ｒ
平均节间长在自然光和遮荫条件下的比值( 孙祖 (Ｌｉｖａｋ ＆ Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００１)ꎮ
东等ꎬ２０１７ꎻ张志鹏ꎬ２０１９)ꎮ １.５ ＧｍＹＵＣ２ 基因序列变异分析
１.３ ＧｍＹＵＣ２ 基因编码区(ＣＤＳ)的克隆 根 据 ＳｏｙＢａｓｅ 数 据 库 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｓｏｙｂａｓｅ.
ＳｏｙＢａｓｅ 数据库( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.ｓｏｙｂａｓｅ.ｏｒｇ / ) 中 ｏｒｇ / )基因注释结果ꎬ确定 ＧｍＹＵＣ２ 基因位置ꎻ利用
公布的 Ｇｌｙｍａ.０５ｇ２３１１００ 基因编码区(ＣＤＳ) 序列ꎬ Ｖｃｆｔｏｏｌｓ(ｖ０.１.１７) 从 ３９４ 份中国南方大豆自然变
利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计特异性引物ꎬ引 异群体材料基因型数据中提取目标基因内的 ＳＮＰ
物序列 ＹＵＣ２￣ＫｐｎＩ￣Ｆ:ＧＧＴＡＣＣＧＴＴＴＣＴＧＴＴＴＡＴＧＣ 基因 型 信 息ꎬ 分 别 用 ＳｎｐＥｆｆ ( ｖ５. ０) 和 Ｈａｐｌｏｖｉｅｗ
２
ＣＣＴＧＣＴＡＣＴＣꎬＹＵＣ２￣ＸｂａＩ￣Ｒ:ＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＡＴＡ (ｖ２.０) 软件进行注释及计算ꎬ并依据标记间 ｒ 计
ＴＣＡＡＡＧＧＣＴＴＧＧＧＴＧＴＣꎬ引物由武汉晴科生物技 算结 果ꎬ 对 标 记 间 ＬＤ 热 图 可 视 化ꎻ 利 用 ＲＴＭ￣
术有限公司合成ꎮ 使用 ＲＮＡ 提取试剂盒ꎬ从强耐 ＧＷＡＳ 软件和 ＳＮＰ 基因型数据构建 ＧｍＹＵＣ２ 基因
荫大豆品种‘贡豆 ７ 号’ 幼苗叶片中提取 ＲＮＡꎬ用 的单倍型ꎬ并对基因单倍型进行可视化ꎻ利用 Ｒ
１％琼脂糖凝胶电泳进一步检测 ＲＮＡ 质量ꎬ以反转 (ｖ４.３.１) 语言 程 序 对 不 同 单 倍 型 个 体 表 型 进 行
录产生的 ｃＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 反应体系 Ｗｅｌｃｈ Ｔｗｏ Ｓａｍｐｌｅ ｔ￣ｔｅｓｔꎮ
５０.０ μＬꎬ其中 ｃＤＮＡ 模板 １.５ μＬ、２×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒ １.６ ＧｍＹＵＣ２ 基因 ＫＡＳＰ 分子标记开发
ＫＯＤ ＦＸ ２５.０ μＬ、２.５ ｍｍｏｌＬ ｄＮＴＰｓ ４.０ μＬ、引 根据 ＧｍＹＵＣ２ 基因的 ３ 个 ＳＮＰ 变异位点ꎬ以
￣１
物 ＹＵＣ２￣ＫｐｎＩ￣Ｆ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ０. ８ μＬ、 引 物 扩增片段长度<１２０ ｂｐ、引物长度 ２０ ~ ２８ ｂｐ、ＴＭ 值
￣１
￣１
ＹＵＣ２￣ＸｂａＩ￣Ｒ(１０ μｍｏｌＬ ) ０.８ μＬ、ＫＯＤ ＦＸ ０.５ ５７ ~ ６０ ℃ 为引物设计原则ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ ３.０ 软件设
μＬꎬ补 ｄｄＨ Ｏ 至 ５０.０ μＬꎻ反应条件为 ９５ ℃ 预变性 计特异性 ＫＡＳＰ 引物ꎬ引物序列如表 ２ 所示ꎮ 以 ８
２
３ ｍｉｎꎬ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ６０ ℃ 退火 １５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 份强耐荫种质和 １０ 份不耐荫种质组成的代表性
９０ ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎬ再 ７２ ℃ ５ ｍｉｎꎬ随后 ４ ℃ 恒温ꎮ 群体为验证材料ꎬ浸种催芽 ３ ｄꎬ每份材料取 ２ 株
扩增产物用 １％琼脂糖凝胶电泳检测后切胶回收ꎮ 幼苗的下胚轴ꎬ用 ＣＴＡＢ 分别提取 ＤＮＡꎬ－８０ ℃ 保
将目的片段连接到克隆载体 ｐＲＥＤ１３０５ꎬ热激转化 存备用ꎮ 将分子标记引物加入同一 ＰＣＲ 反应体
大肠杆菌感受态细胞 ＤＨ５αꎬ经带有 ＬＢ 培养基筛 系ꎬ并设置 ２ 个以超纯水代替样品模版 ＤＮＡ 的空
选出多个阳性克隆ꎬ选择单菌落进行 ＰＣＲ 检测后 白对照ꎬ通过荧光定量 ＰＣＲ 对 １８ 份大豆种质的
送至武汉晴科生物技术有限公司进行测序ꎮ ＤＮＡ 进行扩增ꎮ 反应体系 ５.０ μＬꎬ其中 ＤＮＡ 模板
１.４ ＧｍＹＵＣ２ 基因不同材料表达分析 ５ ~ １００ ｎｇ、ＦＬｕ￣Ａｒｍｓ ２ｘ ＰＣＲ Ｍｉｘ ２.５ μＬ、ＫＡＳＰ 上
将强耐荫材料‘矮脚早’‘贡豆 ７ 号’和极不耐 游分型引物 ＦＡＭ(１０ μｍｏｌＬ ) ０.０７５ μＬ、ＫＡＳＰ
￣１
荫的‘齐佩华’‘直子豆’４ 个具有代表性的大豆品 上游 分 型 引 物 ＨＥＸ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ０. ０７５ μＬ、
￣１
￣１
种种植在 ３０％ 遮光度的遮荫棚内ꎬ每个材料设 ３ ＫＡＳＰ 下 游 通 用 引 物 ＣｏｍＲ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ０. ２
个生物学重复ꎬ于出苗 ５０ ｄ 时取嫩叶片ꎮ 以叶片 μＬꎬ补 ｄｄＨ Ｏ 至 ５.０ μＬꎮ 反应条件为 ９４ ℃ 预变性
２
总 ＲＮＡ 为模板ꎬ将其反转录成 ｃＤＮＡꎬ选择 β￣ａｃｔｉｎ ３ ｍｉｎꎬ１ 个循环ꎻ９５ ℃ 变性 １５ ｓꎬ６３.４ ~ ５７ ℃ 退火
基因为内参基因ꎬ并根据目的基因和内参基因的 ４５ ｓꎬ每 １ 个循环降低 ０.８ ℃ ꎬ９ 个循环ꎻ９４ ℃ 变性
序列ꎬ利用 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０ 软件设计特异性引 １５ ｓꎬ５７.５ ℃ 退火 ４５ ｓꎬ４５ 个循环ꎻ循环结束后再
物ꎬ引物序列 ｑＹＵＣ２￣Ｆ:ＴＴＣＣＣＴＣＴＴＡＴＣＣＡＡＣ ３０ ℃ 延伸 ３０ ｓꎮ 反应完成后ꎬ利用多功能酶标仪
ＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡꎻｑＹＵＣ２￣Ｒ:ＣＴＧＡＣＡＡＡＣＡＴＡＴＴＣＴＧＴ 检测荧光ꎬ根据读取的荧光ꎬ分别计算 ＦＡＭ / ＲＯＸ
ＣＴＣＣＴＣＣＴꎮ 每个样本的 ｃＤＮＡ 均重复 ３ 次( 技术 和 ＨＥＸ / ＲＯＸ 的比值ꎬ获得验证材料的基因型ꎮ
重复)ꎬ 采 用 两 步 法 进 行 ＰＣＲ 扩 增ꎮ 反 应 体 系
２０.０ μＬꎬ其中 ｃＤＮＡ 模板 ３.０ μＬ、Ｂｉｏｒｕｎ Ｐｆｕ ＰＣＲ ２ 结果与分析
￣１
Ｍｉｘ １０. ０ μＬ、 ｑＹＵＣ２￣Ｆ ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ０. ８ μＬ、
ｑＹＵＣ２￣Ｒ( １０ μｍｏｌ Ｌ ) ０. ８ μＬꎬ 补 ｄｄＨ Ｏ 至 ２.１ ＧｍＹＵＣ２ 基因克隆
￣１
２
２０.０ μＬꎻ反应条件为 ９４ ℃ 预变性 ３０ ｓꎬ９５ ℃ 变性 用 Ｇｌｙｍａ.０５ｇ２３１１００ 基因特异性引物ꎬ以强耐
