Page 92 - 《广西植物》2025年第7期

１ ２ ８ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
Ｖａｓｉｌｉｏｕꎬ ２００３)ꎮ Ｐａｎ 等( １９８１) 首先在菠菜中成 物品种资源研究所种质资源圃(海南儋州) 采集巴
功 分 离 出 ＢＡＤＨ 蛋 白ꎮ Ｗｅｒｅｔｉｌｎｙｋ 和 Ｈａｎｓｏｎ 西蕉幼苗叶片ꎬ取样后迅速放入液氮速冻ꎬ之后于
(１９９０) 克隆到菠菜 ＢＡＤＨ 基因编码序列ꎮ ＢＡＤＨ －８０ ℃ 超低温冰箱保存备用ꎮ
是高等植物中 ＧＢ 合成过程中的关键酶之一ꎬ具有 １.２ 方法
醛脱氢酶保守结构域ꎬ对底物甜菜碱醛具有高度 １.２.１ ＲＮＡ 的提取和 ｃＤＮＡ 的合成 采用植物多
专一性ꎬ通过催化不可逆的还原反应将甜菜碱醛 糖多酚 ＲＮＡ 提取试剂盒[天根生化科技( 北京) 有
还原成 ＧＢꎬ该反应依赖辅因子 ＮＡＤ 或 ＮＡＤＰ ꎬ并 限公司]从香蕉叶片中分离总 ＲＮＡ 后ꎬ取 １ μｇ 纯
＋
＋
＋
且植物 ＢＡＤＨ 对 ＮＡＤ 表现出更高的活性( Ｍｕñｏｚ 化 ＲＮＡ 样 本ꎬ 使 用 Ｐｒｉｍｅ Ｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０)ꎮ 植物 ＣＭＯ 和 ＢＡＤＨ 可以响应多种 (Ｔａｋａｒａꎬ 日 本) 进 行 反 转 录 合 成 ｃＤＮＡꎮ 所 得
非生物胁迫ꎬ并调控植物作出相应的生理生化反 ｃＤＮＡ 产物经标准化处理ꎬ分装后置于－２０ ℃ 低温

应以 提 高 植 物 抗 逆 性 ( Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９ꎻ 冰箱保存ꎬ供后续实验使用ꎮ
Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎮ １.２.２ ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 的克隆 基于香蕉基因
在原核生物中诱导异源蛋白表达并分离蛋白 组 数 据 库 ( ｈｔｔｐ: / / ｂａｎａｎａ￣ｇｅｎｏｍｅ￣ｈｕｂ. ｓｏｕｔｈｇｒｅｅｎ.
是获得离体活性蛋白的高效方法之一( Ｔｈａｋｕｒ ＆ ｆｒ / )公 布 的 ＡＡ 型 野 生 蕉 ( Ｍｕｓａ ａｃｕｍｉｎａｔａꎬ ＤＨ￣
Ｓｈａｎｋａｒꎬ ２０１７)ꎮ 罗 笛 等 ( ２０１２ ) 将 水 稻 ( Ｏｒｙｚａ Ｐａｈａｎｇ) 基 因 组 信 息ꎬ 检 索 选 取 ＭａＣＭＯ 基 因
ｓａｔｉｖａ)ＢＡＤＨ 和菠菜 ＢＡＤＨ 构建到 ｐＥＴ３２ａ 表达载 (Ｍａｃｍａ４＿０７＿ｇ２２３３０) 与 ＭａＢＡＤＨ 基因( Ｍａｃｍａ４＿
体上ꎬ诱导 表 达 了 ＧＳＴ￣ＢＡＤＨ 融 合 蛋 白ꎻ黄 卓 等 ０９＿ｇ１６３２０)参考序列设计特异性引物( 表 １)ꎮ 采
(２０１３) 在 大 肠 杆 菌 中 诱 导 表 达 了 辽 宁 碱 蓬 用同源克隆法克隆 ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 基因ꎬＰＣＲ
(Ｓｕａｅｄａ ｌｉａｏｔｕｎｇｅｎｓｉｓ) ＢＡＤＨ 蛋白ꎬ并对离体蛋白 扩增体系选用南京诺唯赞生物科技有限公司的
进行了体外酶活性测定ꎻ柳娜(２００７) 通过 ｐＥＴ２８ａ ２ × Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ Ｐ５２５ 酶ꎬ其中 ＭａＢＡＤＨ
表达系统在大肠杆菌中成功诱导表达了菠菜 ＣＭＯ 扩增程序设定如下:先 ９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎻ随后进
蛋白ꎮ 我们前期研究表明外源 ＧＢ 可缓解渗透胁 行 ３５ 个循环(９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５９ ℃ 退火 ３０ ｓꎬ７２
迫下香蕉的生理响应(唐露等ꎬ２０２３)ꎬ在不同基因 ℃ 延伸 ５０ ｓ)ꎻ最后 ７２℃ 终延伸 ５ ｍｉｎꎮ ＭａＣＭＯ 扩
型香蕉中鉴定到了分别来源于香蕉 Ａ、Ｂ 基因组的 增参数则调整退火温度为 ５７ ℃ ꎬ延伸时间延长至
ＣＭＯ 和 ＢＡＤＨ 基因ꎬ认为其可能与不同基因型香 ６０ ｓꎬ其余步骤同前ꎮ 扩增产物经 １.５％琼脂糖凝
蕉胁迫抗性差异具有相关性( 朱博为等ꎬ２０２４)ꎮ 胶电泳分离后ꎬ采用长沙艾科瑞生物工程有限公
因此ꎬ为从蛋白水平上揭示香蕉 Ａ、Ｂ 基因组 ＣＭＯ 司的 ＳｔｅａｄｙＰｕｒｅ ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒进行片段回
和 ＢＡＤＨ 蛋白结构和酶学特性ꎬ深入探索其对不 收ꎬ并利用同品牌 ＰＣＲ 反应液纯化试剂盒完成纯
同基因型香蕉胁迫响应能力的影响ꎬ本研究以我 化处理ꎮ 将纯化 ＤＮＡ 片段与南京诺唯赞生物科技
国华南主栽品种巴西蕉为试验材料ꎬ根据香蕉参 有限公司的 ｐＣＥ２ ＴＡ/ Ｂｌｕｎｔ￣Ｚｅｒｏ 载体连接构建重组
考基因组ꎬ克隆鉴定 ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨꎬ并进行 质粒ꎬ转化上海唯地生物技术有限公司的 ＤＨ５α 感

原核表达ꎮ 本研究旨在从技术上探索香蕉 ＣＭＯ 受态细胞ꎮ 阳性克隆筛选采用诺唯赞 ２ × Ｒａｐｉｄ Ｔａｑ
和 ＢＡＤＨ 活性蛋白分离方法ꎬ为后续从蛋白水平 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＰＣＲ 体系进行菌液扩增鉴定ꎬ最终委托
上揭示香蕉 Ａ、Ｂ 基因组 ＣＭＯ 和 ＢＡＤＨ 功能差异 北京擎科生物科技有限公司完成测序验证ꎮ
奠定基础ꎬ为香蕉不同基因组同源基因功能差异 １.２.３ ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 蛋白结构预测 采用
研究提供参考ꎮ 在实践上ꎬ提供香蕉抗旱耐盐栽 ＭＥＧＡ 软件( ｖ１１.０.１３) 对 ＭａＣＭＯ 与 ＭａＢＡＤＨ 蛋
培和育种理论基础ꎬ为香蕉抗旱耐盐栽培和育种 白序列进行多重序列比对并构建系统进化树ꎬ拓

提供理论依据ꎬ促进香蕉产业可持续发展ꎮ 扑结构可视化处理通过 Ｊａｌｖｉｅｗ 软件( ｖ２.１１.２７) 实
现ꎮ 通 过 ＮＣＢＩ ＣＤ￣Ｓｅａｒｃｈ 在 线 平 台 ( ｈｔｔｐｓ: / /
１ 材料与方法 ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ) 进行 ＣＭＯ 和 ＢＡＤＨ 蛋白
家 族 保 守 结 构 域 比 对 分 析ꎬ 明 确 ＭａＣＭＯ 与
１.１ 植物材料 ＭａＢＡＤＨ 的保守基序分布特征ꎮ 蛋白质理化性质
于 ２０２３ 年 ６ 月在中国热带农业科学院热带作 评估依托 Ｅｘｐａｓｙ ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线服务平台(ｈｔｔｐ: / /