Page 93 - 《广西植物》2025年第7期
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７ 期 朱博为等: 巴西蕉 ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 原核表达体系筛选及纯化 １ ２ ８ ５
表 １ 本研究所用引物
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
引物名称 引物序列(５′－３′) 用途
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) Ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ＭａＢＡＤＨ￣Ｆ ＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣ 基因克隆
Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ
ＭａＢＡＤＨ￣Ｒ ＣＴＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡ
ＭａＣＭＯ￣Ｆ ＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡＧ
ＭａＣＭＯ￣Ｒ ＴＴＡＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＧ
Ｍ１３￣Ｆ ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ ＤＨ５α 阳性筛选
ＤＨ５α ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
Ｍ１３￣Ｒ ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ
ｐＥＴ２８ａ￣Ｆ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ ＢＬ２１(ＤＥ３)阳性筛选
ＢＬ２１(ＤＥ３) ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ
ｐＥＴ２８ａ￣Ｒ ＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧＣＧＧ
ｐＥＴ２８ａ￣ＢＡＤＨ￣Ｈｉｎｄ Ⅲ￣Ｆ ｔｃｇａｇｃｔｃｃｇｔｃｇａｃａａｇｃｔＡＴＧＧＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＣＣＧ 原核表达载体构建
Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ
ｐＥＴ２８ａ￣ＢＡＤＨ￣Ｈｉｎｄ Ⅲ￣Ｒ ｃｔｃｇａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔＣＡＧＣＴＴＧＧＡＴＧＧＡＧＡＣＧＧＡＴＡ
ｐＥＴ２８ａ￣ＣＭＯ￣Ｈｉｎｄ Ⅲ￣Ｆ ｔｃｇａｇｃｔｃｃｇｔｃｇａｃａａｇｃｔＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＴＡＧＴＧＧＣＡＡＡ
ｐＥＴ２８ａ￣ＣＭＯ￣Ｈｉｎｄ Ⅲ￣Ｒ ｃｔｃｇａｇｔｇｃｇｇｃｃｇｃａａｇｃｔｔＧＡＴＧＴＴＡＣＣＡＡＧＧＣＡＣＴＣＡＴＧＣＡ
ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / )ꎬ系统解析了目标蛋白 １.２.５ 表达体系筛选 取阳性克隆菌液按 １％比例
的氨基酸组成、分子量及理论等电点等参数ꎮ 二 接菌到 ５ ｍＬ ＬＢ 液体培养基中( ＫａｎＲ 抗性)ꎬ３７
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级结 构 特 征 通 过 Ｐｒａｂｉ 在 线 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｎｐｓａ￣ ℃ 、２００ ｒｍｉｎ 摇菌条件下到 ＯＤ ＝ ０.６ꎮ 在加入
６００
ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ.ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ) 解析ꎬ三级构象模型则借助 诱导剂 ＩＰＴＧ 前取样 １ ｍＬ 菌液作为未诱导菌液对
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Ｓｗｉｓｓ￣ｍｏｄｅｌ 同 源 建 模 平 台 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. 照ꎬ１ ｍＬ 对 照 菌 液 １２ ０００ ｒ ｍｉｎ 离 心 １０ ｍｉｎ
ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ) 构建ꎮ 亚细胞定位预测采用 ＰＳＯＲＴ (ＣｅｎｔＲｉｆｕｇｅ７４１２ꎬＧｅｒｍａｎｙ)ꎬ弃上清液－２０ ℃ 保存
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在线 分 析 系 统 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ. ｃｏｍ / ｐｓｏｒｔ. 待用ꎮ 设置 ＩＰＴＧ 终浓度为 ０.１、０.５、１.０ ｍｏｌＬ ꎬ
ｈｔｍｌ)ꎬ 通 过 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / 搭配 １６ ℃ ＋２４ ｈ、２８ ℃ ＋１８ ｈ 和 ３７ ℃ ＋１２ ｈ ３ 种条
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / )评估蛋白亲疏水特性ꎬ跨膜拓扑结构则 件进行诱导ꎬ２００ ｒｍｉｎ 振荡诱导ꎮ １２ ０００ ｒ
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运 用 ＴＭＨＭＭ 算 法 ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎ 后弃上清液ꎬ使用 ２００ μＬ Ｌｙｓｉｓ
ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ / )进行预测ꎮ ｂｕｆｆｅｒ(上海雅酶生物医药科技有限公司) 重悬菌
１.２.４ 原 核 表 达 载 体 构 建 利 用 同 源 重 组 法 将 液ꎬ使用超声波细胞粉碎机( ＪＹ９２￣ＩＩＮꎬ宁波新芝)
ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 基因编码序列构建到经 Ｈｉｎｄ 以 １５％功率、破碎时间 ２ ｓ、间歇 ５ ｓ 破碎菌体至菌
Ⅲ限 制 性 核 酸 内 切 酶 线 性 化 ( Ｔｈｅｒｍｏꎬ ＵＳＡ) 的 液澄清透明ꎬ１２ ０００ ｒｍｉｎ 离心 １０ ｍｉｎꎬ收集上
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ｐＥＴ２８ａ 原核蛋白表达载体上ꎬ３７ ℃ 水浴 ３０ ｍｉｎꎬ 清液并沉淀ꎬ沉淀使用 ２００ μＬ １ × ＰＢＳ 溶液[生工
使用 １０ × ＦａｓｔＤｉｇｅｓｔ Ｇｒｅｅｎ Ｂｕｆｆｅｒ(ＴｈｅｒｍｏꎬＵＳＡ)作 生物工程(上海)股份有限公司]重悬ꎬ上清液与沉
为缓冲液ꎮ ＭａＣＭＯ 和 ＭａＢＡＤＨ 基因 ＰＣＲ 扩增引 淀各加入 ５０ μＬ ５ × ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 蛋白上样缓冲液
物见表 １ꎬ使用 ２ × Ｓｅａｍｌｅｓｓ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｍｉｘ(北京博迈 (上海碧云天生物技术有限公司)ꎬ混匀后 １００ ℃
德基因技术有限公司) 无缝克隆酶对 ＭａＣＭＯ 和 水浴 ５ ｍｉｎꎬ 冷 却 至 室 温 后ꎬ 取 ８ μＬ 进 行 ＳＤＳ￣
ＭａＢＡＤＨ 基因扩增片段和 ｐＥＴ２８ａ 线性化载体进 ＰＡＧＥ 电泳检测ꎬＯｍｎｉ￣Ｅａｓｙ ＴＭ 一 步 法 ＰＡＧＥ 凝 胶
行连接ꎬ连接产物转化 ＢＬ２１( ＤＥ３) 大肠杆菌感受 快速制备试剂盒( 上海雅酶生物医药科技有限公
态(上海唯地生物技术有限公司) 涂布于 ＬＢ 固体 司)制备 １０％ＰＡＧＥ 胶ꎬ使用 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 垂直电泳
培养基(ＫａｎＲ 抗性) 上ꎬ菌液 ＰＣＲ 筛选阳性克隆ꎬ 仪(ＨｏｅｆｅｒꎬＵＳＡ)１５０ Ｖ、６０ ｍｉｎ 条件进行电泳ꎮ 电
检测引物见表 １ꎮ 泳结束后ꎬ将浓缩胶放入考马斯亮蓝 Ｒ２５０ 溶液中
