Page 167 - 《广西植物》2025年第8期
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８ 期 鲍薇等: 砂藓 ＳＭＰＤ 基因的克隆及对干旱和高温胁迫响应分析 １ ５ ３ ３
(马天意等ꎬ ２０２１)ꎬ选用 ＲｃＴＵＢ１ 作为砂藓内参基 １. ２. ４ 生 物 信 息 学 分 析 使 用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 软 件
因(Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎬ实时荧光定量 ＰＣＲ 实验于 (ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 预 测 蛋 白 质
ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 公 司 生 产 的 ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ １ 理 化 性 质ꎻ 使 用 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ.
系统上进行ꎬ所用反应试剂为 ＴＢ Ｇｒｅｅｎ ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / ) 预测蛋白质亲疏水性ꎻ使用
Ｔａｑ Ⅱ( Ｔｉｌ ＲｎａｓｅＨ Ｐｌｕｓ)ꎬ购自 ＴａＫａＲａ 公司ꎮ 通 ＴＭＨＭＭ￣２.０ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.
过 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 软件设计基因引物( 表 １)ꎬ引 ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２.０ / ) 预测蛋白质跨膜结
物由黑龙江箭速基因科技有限公司合成ꎮ 反应体 构 域ꎻ 使 用 ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｅｒｖｉｃｅｓ.
系、程序及结果分析方法同 Ｐｅｎｇ 等(２０２３)ꎮ ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ.ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ￣５. ０ / ) 预 测 蛋 白
质 信 号 肽ꎻ 使 用 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / /
表 １ 实时荧光定量 ＰＣＲ 引物序列 ｗｗｗ.ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ.ｃｏｍ / ｗｏｌｆ￣ｐｓｏｒｔ. ｈｔｍｌ? ｓｒｃ ＝ ｌｅｆｔｂａｒ) 预
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｆｏｒ ｑＰＣＲ
测蛋白质亚细胞定位ꎻ使用 ＳＯＰＭＡ 软件( ｈｔｔｐｓ: / /
基因名称 引物名称 引物序列(５′→３′) ｎｐｓａ￣ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿ ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝
Ｇｅｎｅ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′→３′)
ｎｐｓａ ＿ ｓｏｐｍａ. ｈｔｍｌ) 预 测 蛋 白 质 二 级 结 构ꎻ 使 用
ＲｃＴＵＢ１ ｑＲｃＴＵＢ１￣Ｆ ＡＧＣＣＴＣＣＧＣＡＴＴＣＴＧＴＴＣＧ
ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 软 件 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ.
ｑＲｃＴＵＢ１￣Ｒ ＣＴＣＣＣＡＧＣＡＣＧＣＡＴＴＣＣＣ
ｏｒｇ / ｉｎｔｅｒａｃｔｉｖｅ)预测蛋白质三级结构ꎮ
ＲｃＳＭＰＤ ｑＲｃＳＭＰＤ￣Ｆ ＣＴＴＣＡＧＣＡＣＧＡＴＴＣＡＴＡＴＡＡＧＡＴＡＧＴＴＧ
１.２.５ 植物表达载体的构建 根据南京诺唯赞生
ｑＲｃＳＭＰＤ￣Ｒ ＡＴＣＣＧＴＣＧＣＣＴＴＧＡＡＡＧＴＣＴＣＣ ®
物科技股份有限公司生产的 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ⅱ Ｏｎｅ
ＡｔＡｃｔｉｎ２ ｑＡｔＡｃｔｉｎ２￣Ｆ ＣＣＣＧＣＴＡＴＧＴＡＴＧＴＣＧＣ
Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 试 剂 盒 说 明 书 要 求ꎬ 设 计 用 于
ｑＡｔＡｃｔｉｎ２￣Ｒ ＡＡＧＧＴＣＡＡＧＡＣＧＧＡＧＧＡＴ
ＲｃＳＭＰＤ 表达 载 体 构 建 的 引 物 ＩＦ￣ＲｃＳＭＰＤ￣Ｆ( ５′￣
ＡＴＧＣＣＣＧＴＣＧＡＣＣＣＣＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＣＣ￣３′) 和
１.２. ２ ＲｃＳＭＰＤ 基 因 ＣＤＳ 的 克 隆 使 用 Ｐｒｉｍｅｒ ＩＦ￣ＲｃＳＭＰＤ￣Ｒ (５′￣ＧＧＡＴＣＣＧＧＴＡＣＣＣＣＣＴＴＡＣＧＣＣＡ
Ｐｒｅｍｉｅｒ ５ 软件在 ＲｃＳＭＰＤ 编码序列的两端设计引 ＡＴＧＣＴＡＴ￣３′)ꎬ以构建成功的克隆载体质粒为模
物 ＲｃＳＭＰＤ￣Ｆ ( ５′￣ＡＴＧＧＣＡＡＡＧＧＡＴＡＣＣＡＣＧＣＡＧ￣ 板进行 ＰＣＲꎬ反应体系及程序同 １.２.１ꎮ 将 ＰＣＲ 产
３′)和 ＲｃＳＭＰＤ￣Ｒ(５′￣ＴＴＡＣＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＴＡＧＡＡＧ 物进行 纯 化 和 回 收ꎮ 使 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶
ＣＣＡＡＧ￣３′)ꎬ引物由黑龙江箭速基因科技有限公 ＱｕｉｃｋＣｕｔ Ｓｍａ Ｉ(ＴａＫａＲａ 公司) 根据说明书方法对
司合成ꎮ 以反转录合成的砂藓 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ对 ｐＲＩ１０１￣ＡＮ 空载体质粒进行单酶切ꎬ回收线性化
ＲｃＳＭＰＤ 基因的 ＣＤＳ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ反应体系及 载体后ꎬ根据南京诺唯赞生物科技股份有限公司
程序同沙伟等(２０２０ｂ)ꎮ 获得 ＰＣＲ 产物后使用南 生产的 ＣｌｏｎＥｘｐｒｅｓｓ Ⅱ Ｏｎｅ Ｓｔｅｐ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 说明
®
® 书将目的基因 ＤＮＡ 片段与 ｐＲＩ１０１￣ＡＮ 线性化载
京诺唯赞生物科技股份有限公司生产的 ＦａｓｔＰｕｒｅ
Ｇｅｌ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 试剂盒进行回收纯化 体进行重组ꎮ 将重组产物使用热激法转化大肠
￣１
并保存于－２０ ℃ 冰箱ꎮ 杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ利用含 ５０ ｕｇｍＬ 卡那
１.２.３ 克隆载体的构建及测序 按照 ＴａＫａＲａ 公司 霉素的 ＬＢ 固体培养基筛选含有成功构建植物表
生产的 ｐＭＤＴＭ１９￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 将回收产物 达载体质粒的菌株ꎬ扩繁菌液后进行菌液 ＰＣＲ 鉴
与克隆载体进行载体连接ꎬ连接成功后使用热激 定ꎬ菌液培养及鉴定方法同马天意等( ２０２１) ꎬ对
法转化大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞ꎬ转化及菌株 已成功构建植物表达载体菌株的菌液进行质粒
鉴定方法同马天意等(２０２１)ꎮ 使用购自南京诺唯 提取ꎬ并 将 提 取 获 得 的 质 粒 保 存 于 － ２０ ℃ 冰 箱
®
赞 生 物 科 技 股 份 有 限 公 司 生 产 的 ＦａｓｔＰｕｒｅ 备用ꎮ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 试剂盒对已成功构建克隆菌株的 １.２.６ ＲｃＳＭＰＤ 过表达转基因植株的构建 将构建
菌液进 行 质 粒 提 取ꎬ 并 将 提 取 获 得 的 质 粒 置 于 成功的植物表达载体转化根癌农杆菌 ＥＨＡ１０５ 株
－２０ ℃ 冰箱保存ꎮ 克隆载体质粒经 ＰＣＲ 验证后送 系感受态细胞ꎬ参照马天意等(２０２１) 的方法ꎬ在 ４
至睿博兴科生物技术有限公司( 哈尔滨) 进行测 ℃ 条件下ꎬ将春化 ３ ｄ 的野生型拟南芥种子点播在
序ꎬ使用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件对测序结果与转录组预测序 装有已高压灭菌的混合营养土( 腐殖土与蛭石的
列进行比对分析ꎮ 比例为 １ ∶ ２)的小花盆(７ ｃｍ × ７ ｃｍ × ８ ｃｍ) 中ꎮ
