Page 169 - 《广西植物》2025年第8期

８ 期 鲍薇等: 砂藓 ＳＭＰＤ 基因的克隆及对干旱和高温胁迫响应分析 １ ５ ３ ５

带进行回收纯化后构建克隆载体ꎬ以 ＲｃＳＭＰＤ 克 测序数据一致ꎬ说明 ＲｃＳＭＰＤ 基因的 ＣＤＳ 被成功
隆载体质粒为模板进行验证( 图 ２:Ｂ)ꎬ将验证成 克隆ꎬＲｃＳＭＰＤ 基因的 ＣＤＳ 及其编码的氨基酸序
功的克隆载体质粒进行测序ꎬ测序结果与转录组 列如图 ３ 所示ꎮ

Ａ Ｍ. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ . 水对照ꎻ １、２. ＲｃＳＭＰＤ 的 ＣＤＳ 序列 ＰＣＲ 扩增产物ꎮ Ｂ Ｍ. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ . 水对照ꎻ
１、２. 含有 ＲｃＳＭＰＤ 克隆载体的大肠杆菌菌液ꎮ
Ａ Ｍ. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ . Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ １ꎬ ２. ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ＣＤＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ＲｃＳＭＰＤ. Ｂ Ｍ. ＤＬ ２ ０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ
. Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ １ꎬ ２. Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＲｃＳＭＰＤ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ.
图 ２ ＲｃＳＭＰＤ 基因 ＣＤＳ 的 ＰＣＲ 扩增(Ａ)及克隆载体质粒的验证(Ｂ)
Ｆｉｇ. ２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＤＳ ｏｆ ＲｃＳＭＰＤ(Ａ) ａｎｄ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒ ｐｌａｓｍｉｄｓ (Ｂ)

２.３ ＲｃＳＭＰＤ 蛋白质的生物信息学预测 体构建成功(图 ５:Ａ)ꎮ 将 ＲｃＳＭＰＤ 的植物表达载
通过生物信息学工具预测分析ꎬ显示 ＲｃＳＭＰＤ 体转化到根癌农杆菌中为构建转基因拟南芥植株
总氨基酸残基数为 ３２６ꎬ相对分子质量为 ３６.３５３ １２ 作准备ꎬ以筛选出具有卡那霉素抗性的根癌农杆
ｋＤａꎬ 理 论 等 电 点 为 ６. ４２ꎬ 分 子 式 为 菌阳性菌株的菌液为模板进行 ＰＣＲ 验证ꎬ结果显
Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ脂肪系数为 ７９.８５ꎬ总平均亲水 示农杆菌菌液泳道有与阳性对照泳道中条带位置
１ ６３２ ２ ５３２ ４３０ ４９５ ８
系数－０.３４８ꎬ稳定系数为 ４１.０３ꎬ是一种不稳定蛋 相近的单一条带ꎬ表明植物表达载体已成功转入
白质ꎮ 进一步分析显示 ＲｃＳＭＰＤ 为亲水性蛋白质 到根癌农杆菌中(图 ５:Ｂ)ꎮ
(图 ４:Ａ)ꎬ不具有跨膜结构域( 图 ４:Ｂ) 和信号肽 利用转入 ＲｃＳＭＰＤ 植物表达载体的农杆菌侵
(图 ４: Ｃ )ꎮ 亚 细 胞 定 位 预 测 得 分 结 果 显 示 染野生型拟南芥ꎬ收取 Ｔ 代种子ꎬ在含卡那霉素的
０
ＲｃＳＭＰＤ 定位在叶绿体的可能性最高ꎬ其次为液 ＭＳ 培养基上筛选出能够正常生长的 ＲｃＳＭＰＤ 过
泡ꎬ也有可能定位在细胞核及线粒体ꎮ 对 ＲｃＳＭＰＤ 表达 转 基 因 拟 南 芥 Ｔ 代 植 株 ( 图 ６: Ａ)ꎮ 以
１
蛋白质的二级结构进行预测ꎬ结果显示 ＲｃＳＭＰＤ ＲｃＳＭＰＤ 过表达转基因拟南芥 Ｔ 代植株叶片基因
１
蛋白质由 ２７.６１％ α 螺旋、３.９９％ β 折叠、２１.４７％ 组 ＤＮＡ 为模板ꎬ使用 ＲｃＳＭＰＤ 的 ｑＰＣＲ 引物进行
延伸 链 和 ４６. ９３％ 无 规 卷 曲 组 成 ( 图 ４: Ｄ)ꎮ 对 鉴定ꎬ结果显示在 Ｔ 代植株 ＤＮＡ 泳道出现一条单
１
ＲｃＳＭＰＤ 蛋白质的三级结构进行预测ꎬ结果如图 一明亮的条带ꎬ并且与阳性对照条带位置一致ꎬ表

(４:Ｅ)所示ꎮ 明成功获得 ＲｃＳＭＰＤ 过表达转基因拟南芥 Ｔ 代植
１
２.４ ＲｃＳＭＰＤ 过表达转基因拟南芥的构建 株(图 ６:Ｂ)ꎮ 以筛选获得的 Ｔ 代 ＲｃＳＭＰＤ 过表达
２
以成功构建的克隆载体质粒为模板进行 ＰＣＲ 转基因拟南芥植株叶片 ＲＮＡ 为模板合成 ｃＤＮＡꎬ
后回收目的条带ꎬ与植物表达载体 ｐＲＩ１０１￣ＡＮ 进 以此 ｃＤＮＡ 为 模 板 进 行 ｑＰＣＲ 以 鉴 定 植 株 中
行重组ꎬ将重组产物转化到大肠杆菌中ꎬ对筛选出 ＲｃＳＭＰＤ 的表达量ꎬ结果显示在过表达转基因拟南
具有抗卡那霉素的阳性菌株进行菌液扩繁后提取 芥 Ｔ 代植株中检测到的荧光量远高于野生型拟南
２
质粒作为模板进行 ＰＣＲ 验证ꎬ结果显示在相应位 芥ꎬ表明 ＲｃＳＭＰＤ 已成功在转基因植株中超量表
置有清晰明亮的条带ꎬ表明 ＲｃＳＭＰＤ 植物表达载 达(图 ６:Ｃ)ꎮ