Page 119 - 《广西植物》2026年第3期

３ 期 黄明慧等: 钩藤钩发育相关 ＳＥＰＡＬＬＡＴＡ￣ｌｉｋｅ 基因的克隆与表达分析 ４ ９ ５

作为模板ꎬ使用北京天恩泽基因科技有限公司生产 ｃＤＮＡ 序列ꎬ并根据拼接结果分别设计基因 ｃＤＮＡ
的 ５′ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ 和 ３′ ＲＡＣＥ Ｋｉｔ 进行 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因 序列两端引物(表 ２)ꎬ经 ＲＴ￣ＰＣＲ 的扩增、连接、转
编码区侧翼序列的扩增ꎬ扩增产物经电泳检测并切 化和测序ꎬ使用 ＮＣＢＩ 网站 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 在线工具
胶回收目的片段ꎬ同样经连接、转化和测序ꎬ以上测 ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ/ ) 验 证
序结果 经 ＤＮＡＭＡＮ 软 件 进 行 拼 接 得 到 基 因 的 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因编码区的一致性ꎮ

表 １ 钩藤转录组测序数据库 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因信息
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ ｇｅｎｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｓ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａｂａｓｅ ｏｆ Ｕｎｃａｒｉａ ｒｈｙｎｃｈｏｐｈｙｌｌａ

编码区长度
基因 ＩＤ Ｎｒ 数据库注释
ＯＲＦ ｌｅｎｇｔｈ
Ｕｎｉｇｅｎｅ ＩＤ Ｎｒ ｄａｔａｂａｓｅ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ
(ｂｐ)
ＤＮ２３０３６＿ｇ３ (ＳＥＰ１) ７３８ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＥＰＡＬＬＡＴＡ １￣ｌｉｋｅ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ１ [Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ]
ＤＮ４８３２＿ｇ１ (ＳＥＰ３.１) ７２６ ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＧＬ９ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ３ [Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ]
ＤＮ１８２６５＿ｇ１ (ＳＥＰ３.２) ７２９ ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ ｐｒｏｔｅｉｎ ＡＧＬ９ ｈｏｍｏｌｏｇ ｉｓｏｆｏｒｍ Ｘ２ [Ｃｏｆｆｅａ ａｒａｂｉｃａ]

１.２.３ 生物信息学分析 根据 ＲＡＣＥ 扩增后得到的 ３５Ｓ￣ＧＦＰ 载 体 绿 色 荧 光 蛋 白 ( ｇｒｅｅｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ
钩藤 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因编码区序列ꎬ在 ＤＮＡＭＡＮ 软件中 ｐｒｏｔｅｉｎꎬＧＦＰ)基因之前的 Ｘｂａ Ⅰ和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切位
推导出氨基酸序列ꎬ并进行序列比对ꎻ利用 ＮＣＢＩ￣ 点之间ꎮ 构建得到的 ＧＦＰ 融合蛋白表达载体经测
ＣＤＤ 网站( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｃｄｄ / ) 在 序验证后ꎬ按照产品说明书采用冻融法转化至农
线工具预测钩藤 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 蛋白的保守结构域ꎻ利用 杆菌 ＥＨＡ１０５ 感受态细胞( 江苏瑞楚生物科技有

ＭＥＭＥ Ｓｕｉｔｅ 网 站 ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ. ｏｒｇ / ｍｅｍｅ / 限公司)中ꎬ同时转化空载体作为阴性对照ꎮ 筛选
ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ)进行保守基序的在线预测与分析ꎻ利用 得到的阳性菌落扩大培养后采用烟草瞬时转化法

ＥｘＰａＳｙ￣ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / (Ｍａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２３)ꎬ具体以 ＯＤ ６００ 为 ０.８ 的注射液
ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ ) 进 行 蛋 白 的 理 化 性 质 分 析ꎻ 利 用 (１０ ｍｍｏｌ Ｌ ￣１ ＭｇＣｌ 、 １０ ｍｍｏｌ Ｌ ￣１ ＭＥＳ、 １５０
２
￣１
ＴＭＨＭＭ￣２. ０ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / μｍｏｌ Ｌ Ａｃｅｔｏｓｙｒｉｎｇｏｎｅ ) 注 射 到 本 氏 烟 草
ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２. ０ / ) 和 ＳｉｇｎａｌＰ￣４. １ ( ｈｔｔｐｓ:/ / (Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)叶片下表皮ꎬ培养 ４８ ｈ 后
ｓｅｒｖｉｃｅｓ. ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ￣４. １ / ) 在 撕取注射部位表皮并使用 ＤＡＰＩ(４′ꎬ６￣二脒基￣２￣苯
线工具分别进行跨膜结构域和信号肽预测ꎻ利用 基吲哚ꎬ４′ꎬ６￣ｄｉａｍｉｄｉｎｏ￣２￣ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ) 染料( 北京

ＷＯＬＦ ＰＳＯＲＴ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｗｗ. ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ. ｃｏｍ/ ｗｏｌｆ￣ 兰杰 柯 科 技 有 限 公 司) 进 行 细 胞 核 染 色ꎬ 采 用
ｐｓｏｒｔ.ｈｔｍｌ) 和 Ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ ＰｒｏｔＣｏｍｐ ９. ０ ( ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ. Ｏｌｙｍｐｕｓ ＩＸ７３ 荧光倒置显微镜观察并拍照记录ꎮ
ｓｏｆｔｂｅｒｒｙ.ｃｏｍ/ ｂｅｒｒｙ.ｐｈｔｍｌ)在线软件进行蛋白的亚细 １.２.５ 转录激活活性分析 转录激活活性分析采

胞定位预测ꎻ利用 ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｂｉｌ. ｉｂｃｐ. 用酵母单杂系统ꎬ参考高玮林等(２０２２) 的方法ꎬ具
ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ) 体为设计带 Ｎｃｏ Ⅰ和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切位点的引物序
和 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＬＥ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ) 列(表 ２)ꎬ将 ３ 个 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因的完整编码区序列
在线软件分别进行蛋白二级结构和三级结构预测ꎻ 经 ＰＣＲ 扩增、切胶回收以及酶切连接的方法ꎬ分别
根据 ＮＣＢＩ 网 站 Ｂｌａｓｔ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. 插入至 ｐＧＢＫＴ７ 载体 Ｎｃｏ Ⅰ和 ＢａｍＨ Ｉ 酶切位点
ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ.ｃｇｉ)比对结果ꎬ选择同源性较高的氨基酸 之间ꎬ构建好的重组载体转化至酵母 ＡＨ１０９ 感受
序列在 ＭＥＧＡ １１ 软件中进行多序列比对ꎬ采用邻接 态细胞ꎬ同时转化空载体作为阴性对照ꎮ 在色氨
法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ)构建系统发育进化树ꎮ 酸缺陷型(ＳＤ￣Ｗ) 培养基平板上生长并获得阳性
１.２.４ 亚细胞定位分析 将钩藤 ＳＥＰ￣ｌｉｋｅ 基因编码 克隆ꎬ 随 后 在 ＳＤ￣Ｗ 液 体 培 养 基 中 摇 菌 培 养 至
区序列去除终止密码子ꎬ设计带 Ｘｂａ Ⅰ和 ＢａｍＨ Ｉ ＯＤ 为 １.０ꎬ菌液经无菌水梯度稀释 １０、１００、１ ０００
６００
酶切位点的引物序列(表 ２)ꎬ通过 ＰＣＲ 扩增、切胶 倍ꎬ每个稀释度取 ２ μＬ 同时点滴于 ＳＤ￣Ｗ 和加入
回收及 酶 切 连 接 的 方 法ꎬ插 入 至 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０５￣ 了显色反应底物 Ｘ￣α￣ｇａｌ 的色氨酸、组氨酸和腺嘌