Page 8 - 《广西植物》2026年第3期
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３ ８ ４                                  广  西  植  物                                         ４６ 卷
            １.２.３ 细胞外加 ＭＶ 处理  吸弃旧培养基ꎬ在含 α￣                     计量资料以均值±标准差(ｘ±ｓ)表示ꎬ组间比较采用
            Ｓｙｎ ＰＦＦ 的 培 养 基 中 添 加 ＭＶ 至 终 浓 度 为 １００             单因素方差分析ꎬ组内采用 Ｔｕｋｅｙｓ 检验进一步两两
            μｍｏｌＬ (Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎬ于细胞培养箱中继                比较ꎮ 以 Ｐ<０.０５ 为差异ꎬ具有统计学意义ꎮ
                    ￣１
            续培养ꎮ
            １.２.４ ＮＭＤＡＲ１ 质粒转染 ＰＣ１２ 细胞  将 ＰＣ１２ 细                ２  结果与分析
            胞接种于 ６ 孔板及预铺有多聚赖氨酸的 ２４ 孔板
            中ꎮ 接种 ２４ ｈ 后ꎬ 用 Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００ 转 染 试           ２.１ 异常增加的 α￣Ｓｙｎ 下调原代神经元 ＤＲＤ１ 的

            剂ꎬ分别将 ３ μｇ ＮＭＤＡＲ１ 质粒转染至 ２ 孔 ＰＣ１２                   表达
            细胞中ꎮ 转染 ２４ ｈ 后ꎬ向其中 １ 孔 ＰＣ１２ 细胞培养                       本实验分为 ３ 个组ꎬ即对照组( 空白对照组)、

            基中添加超声预处理的 α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ 至终浓度为 １０                      单体组( α￣Ｓｙｎ 单体处理组) 和 ＰＦＦ 组( α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ
            μｇｍＬ ꎬ继续处理 ４８ ｈ( ＮＭＤＡＲ１＋ＰＦＦ 组)ꎮ 其                处理组)ꎮ 经上述处理后ꎬ于 ４８ ｈ 后采用细胞 ＩＦ
                    ￣１
            中ꎬ６ 孔板细胞用于 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 实验ꎬ２４ 孔板细胞                 和 Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测原代神经元中 ＤＲＤ１ 的表达ꎮ
            用于细胞 ＩＦ 实验ꎮ                                        由图 １ 可 知ꎬ 与 对 照 组 相 比ꎬ α￣Ｓｙｎ 单 体 组 ( Ｐ <
                                                   ￣１          ０.０５)及 ＰＦＦ 组(Ｐ<０.０００ １) 中 α￣Ｓｙｎ 荧光强度逐
            １.２.５ 细胞蛋白质提取  用 ０.０１ ｍｏｌＬ 的 ＰＢＳ
            漂洗细胞 ３ 次ꎬ加入适量含蛋白酶抑制剂及磷酸                            渐增高(图 １:Ａ、Ｃ)ꎬ单体组 ＤＲＤ１ 荧光强度稍弱
            酶抑制剂的 ＲＩＰＡ 裂解液ꎬ用细胞刮辅助剥离细                           但无明显差异ꎬ而 ＰＦＦ 组 ＤＲＤ１ 荧光强度显著降
            胞ꎮ 用冰浴裂解 ３０ ｍｉｎ 后ꎬ４ ℃ 、１２ ０００ ×ｇ 离心                低( 图 １:Ａ、ＢꎬＰ < ０.０５)ꎻ图 ２ 结果显示ꎬＷｅｓｔｅｒｎ
            ３０ ｍｉｎ 获取上清液ꎬ用 ＢＣＡ 法测定蛋白浓度后加                       ｂｌｏｔ 结果与 ＩＦ 结果趋势一致ꎬ与对照组相比ꎬ单体
            入上样缓冲液ꎬ并煮沸变性 １０ ｍｉｎꎮ                               组(Ｐ<０.０５)及 ＰＦＦ 组( Ｐ<０.０００ １) α￣Ｓｙｎ 蛋白表
            １.２.６ Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ  用 １２％ ＳＤＳ￣聚丙烯酰胺凝胶              达逐渐增加(图 ２:Ａ、Ｃ)ꎬ单体组 ＤＲＤ１ 的表达有
            电泳分离蛋白且转印至 ＰＶＤＦ 膜ꎬ用 ５％脱脂牛奶                         降低趋势但差异无统计学意义ꎬＰＦＦ 组 ＤＲＤ１ 的表
            在室温下封闭 １ ｈ 后ꎬ分别孵育鼠源 α￣Ｓｙｎ 抗体                       达显著降低(图 ２:Ａ、ＢꎬＰ<０.０１)ꎮ 上述结果表明ꎬ
            (１ ∶ １ ０００)、兔 源 ＤＲＤ１ 抗 体 ( １ ∶ ２ ０００)、鼠 源          α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ 处理可以显著下调 ＤＲＤ１ 表达ꎮ 后续
            ＤＲＤ１ 抗 体 ( １ ∶ ２ ０００ )、 兔 源 ＮＭＤＡＲ１ 抗 体             以 α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ 处理作为 α￣Ｓｙｎ 过表达诱导的 ＰＤ 细
            (１ ∶ １ ０００)、鼠源内参 β￣Ａｃｔｉｎ 抗体(１ ∶ １０ ０００)４           胞模型造模方式ꎮ
            ℃ 过夜ꎬ对应源性荧光二抗(１ ∶ １０ ０００) 室温孵育                     ２.２ ＭⅤ有效缓解异常增加的 α￣Ｓｙｎ 引起的 ＤＲＤ１
            １ ｈꎬＯＤＹＳＳＥＹ 双色红外荧光成像系统扫膜ꎮ 利用                       表达下调
            ＩｍａｇｅＪ 软件分析目的蛋白与内参的灰度值比值ꎬ                              本实验分为 ３ 个组ꎬ即对照组( 空白对照组)、
            进行目的蛋白表达量的半定量分析ꎮ                                   ＰＦＦ 组(α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ 处理组) 和 ＰＦＦ ＋ ＭＶ 组( 同时
            １.２.７ 细胞 ＩＦ 实验  用 ４％多聚甲醛于室温下固定                     添加 α￣Ｓｙｎ ＰＦＦ 和 ＭＶ 组)ꎮ 经上述处理 ４８ ｈ 后
            ３０ ｍｉｎ 后ꎬ加入含 ０.１％ Ｔｒｉｔｏｎ￣Ｘ １００ 的 ＰＢＳ 中室温           进行 ＩＦ 检测ꎮ 结果( 图 ３) 显示ꎬ与对照组相比ꎬ
            渗透 ３０ ｍｉｎꎮ 用 ２％山羊血清于室温下封闭 ２ ｈ 后ꎬ                   ＰＦＦ 组 ＤＲＤ１ 荧光强度显著降低( Ｐ<０.０１)ꎬα￣Ｓｙｎ
            进行兔 源 ＤＲＤ１ 抗 体 ( １ ∶ １ ０００)、 兔 源/ 小 鼠 源            荧光强度显著升高( Ｐ<０.００１) ( 图 ３)ꎮ 而与 ＰＦＦ
            ＮＭＤＡＲ１ 抗体(１ ∶ １ ０００) 和/ 或小鼠源 α￣Ｓｙｎ 抗体              组相比ꎬＰＦＦ＋ＭＶ 组 ＤＲＤ１ 荧光强度则显著增加

            (１ ∶ １ ０００) ４ ℃ 孵育 ２４ ｈꎮ 山羊抗兔 Ａｌｅｘａ￣ｆｌｕｏｒ          (图 ３:Ａ、ＢꎬＰ<０.０５)ꎬ伴随着 α￣Ｓｙｎ 荧光强度明显
            ４８８ / ５９４(１ ∶ ２ ０００)、 山羊抗小鼠 Ａｌｅｘａ￣ｆｌｕｏｒ ４８８ /      减弱(图 ３:Ａ、ＣꎬＰ<０.０５)ꎬＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ 实验结果
            ５９４(１ ∶ ２ ０００) 于室温下孵育 １ ｈ 后ꎬ 进行 ＤＡＰＩ               也显示ꎬＭＶ 处理后ꎬＤＲＤ１ 表达明显上调(图 ７:Ｂꎬ
            (１ ∶ １ ０００)染色 １０ ｍｉｎꎬ于倒置荧光显微镜下拍摄                   Ｐ<０.０１)ꎬ提示 ＭＶ 可有效抑制 α￣Ｓｙｎ 异常增加及

            成像ꎬ利用 ＩｍａｇｅＪ 软件进行荧光强度分析ꎮ                           其导致的 ＤＲＤ１ 表达下调ꎮ
            １.３ 统计学分析                                          ２.３ 异常增加的 α￣Ｓｙｎ 下调原代神经元 ＮＭＤＡＲ１

                 使用 ＩｍａｇｅＪ 软件对 ＩＦ 图荧光强度和 Ｗｅｓｔｅｒｎ               的表达
            ｂｌｏｔ 图灰度值进行定量分析ꎬ利用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ                      本实验可以分为 ３ 个组ꎬ即对照组( 空白对照
            ９.２.０ 软件进行数据统计和分析ꎬ呈近似正态分布的                         组)、 单体组(α￣Ｓｙｎ 单体处理组)和 ＰＦＦ 组(α￣Ｓｙｎ
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