Page 75 - 《广西植物》2026年第4期

４ 期 夏黎明等: 革叶猕猴桃休眠过程中生理变化与转录组分析 ６ ３ ３

到需冷量的需求为止ꎻ室内冷藏样品的取样时间
１ 材料与方法 为 ０、 ９６、 １９２、 ２８８、 ３８４、 ４８０、 ５７６、 ６７２、 ７６８、 ８６４、

９６０、１ ０５６ ｈꎬ每次取出 ２０ 条ꎬ６ 个枝条用于培养ꎬ
１.１ 植物材料 观测芽休眠状态ꎬ剩余枝条用于生理生化指标和
供试材料采自广西壮族自治区中国科学院广 分子试验观测ꎮ

西植物研究所猕猴桃种质资源圃的革叶猕猴桃ꎬ (２)用 于 生 理 生 化 与 分 子 试 验 样 品 材 料 的
具备常绿特性ꎬ多年生已进入结果期的雌株ꎬ统一 采集

栽培于苗圃中ꎬ常规水肥管理ꎬ生长势一致ꎮ 把用于生理生化及分子试验的枝条ꎬ在每次
在冬季猕猴桃自然落叶后ꎬ田间日平均气温 采样时把混合花芽从枝条上剥出后ꎬ立即投入液
降低到连续 ３ ｄ 稳定通过 ７.２ ℃ 时开始采样ꎮ 选 氮中 冻 干ꎬ 保 存 于 冷 冻 管ꎬ 存 放 于 － ８０ ℃ 冰 箱

择树势生长健壮、长势一致无病虫害的 １ 年生枝ꎮ (Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ)备用ꎮ 猕猴桃的花
每份资源选取 ５ 根枝条ꎬ剪去枝条两端ꎬ截成 ３０ ~ 芽为混合芽ꎬ通常花芽比较圆而粗ꎬ而叶芽的形状
４０ ｃｍ 的枝段ꎬ保存于 ４ ℃ 冰箱ꎮ 从取样开始日 相对较为瘦长ꎬ采样时需要仔细辨别ꎮ 取不同低
起ꎬ每 ２ ｄ 从冰箱中取出枝条ꎬ剪成每段包括 ４ ~ ６ 温处理的猕猴桃枝条芽体组织 ０.１ ｇꎬ液氮速冻后
个饱满芽的小段ꎬ最终保证每份资源的总芽量为 研磨ꎬ采用蒽酮比色法测定可溶性糖含量ꎬ以及碘
３０ ~ ５０ 个ꎬ插入盛有清水( 水深 ２ ~ ３ ｃｍ) 的器皿
比色法测定淀粉含量ꎬ具体参照 Ｚｈａｎｇ 等(２０２０)
中ꎬ立即放入智能人工气候箱( ＰＱＸ￣３５０Ｄꎬ宁波东
的方法进行ꎮ 使用植物激素 ＥＬＩＳＡ 试剂盒( 上海
南仪器有限公司ꎬ中国) 进行培养(温度 ２５ ℃ ꎬ 光
钰多生物科技有限公司ꎬ中国) 测定 ＡＢＡ、ＧＡ、生
照时间 １６ ｈꎬ黑暗 ８ ｈꎬ光强 ３ ０００ ｌｘ)ꎮ 每 ２ ｄ 换一
长素吲哚乙酸( ｉｎｄｏｌｅａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄꎬＩＡＡ) 等含量ꎬ操
次水ꎬ并剪去基部 ２ ~ ３ ｍｍꎬ露出枝条基部新茬ꎮ
作按说明书进行ꎮ 样品提取采用甲醇－水－冰乙酸
水培 ２０ ｄ 后统计萌芽率ꎮ 萌芽率及需冷量的统
(８０ ∶ １９ ∶ １ꎬＶ / Ｖ / Ｖ) 溶液ꎬ离心后取上清液进行
计:萌芽标准为枝条芽顶端鳞片开裂、露绿为准ꎻ
检测(王晓霞等ꎬ２０２０)ꎻ分别使用试剂盒( 科铭生
萌芽率达到或超过 ５０％ꎬ即表示该材料已经顺利
物科技有限公司ꎬ中国)测定猕猴桃休眠过程中超
通过休眠ꎻ试验中测定猕猴桃达到需冷量是以连
氧化物歧化酶( ｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅ ｄｉｓｍｕｔａｓｅꎬＳＯＤ) 和过氧
续两次处理的萌芽率均达到 ５０％ 或超过 ５０％ 为
化物酶(ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＰＯＤ) 的活性ꎬ所有测定均设 ３
准ꎬ需冷量和萌芽率均以前一次低温处理的为准ꎬ
次生物学重复ꎬ数据取平均值ꎮ
后次仅作验证ꎮ
１.２.２ 猕猴桃芽休眠的转录组测序与分析 采用
１.２ 试验方法
ＴＲＩｚｏｌ 试 剂 ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＵＳＡ ) 提 取 混 合 芽 总
®
１.２.１ 生理生化指标测定
ＲＮＡꎮ 经 ＮａｎｏＤｒｏｐ ＴＭ ２０００ ( Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ
(１)不同低温处理条件下样品处理与采集
Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃꎬ ＵＳＡ ) 测 定 ＯＤ ꎬ Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００
Ａ(田间自然低温休眠处理):利用农田气象自 ２６０/ ２８０
动监测站(ＨＭＮＬ０８)进行自动观测和记录ꎬ在田间 Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ( Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬ ＵＳＡ) 检 测 ＲＮＡ
日平均气温降低到连续 ３ ｄ 稳定通过 ７.２ ℃ 时开 完整 性 ( ＲＩＮ > ７. ０ ) 后ꎬ 构 建 ｍＲＮＡ 文 库ꎬ 于
ＴＭ
始第一次采样ꎬ有效低温积累时间记为 ０ ｈꎻ因暖 Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００ 测 序 平 台 ( Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ.ꎬ
冬原因没有足够的低温积累ꎬ即有效低温积累不 ＵＳＡ) 进 行 双 端 测 序 ( １５０ ｂｐ )ꎮ 原 始 数 据 经
足ꎬ按照每 ８ ｄ 采集一次ꎬ直到萌芽前 ３０ ｄ 左右达 Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃ(ｖ０.３９)质控后ꎬ比对至猕猴桃参考基
到生态休眠末期ꎻ每次采集 ２０ 个枝条ꎬ６ 个枝条用 因组( Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ｖ３.０ꎬ Ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ ｄａｔａｂａｓｅꎬ
于培养ꎬ观测芽休眠状态ꎬ剩余枝条用于生理生化 ｈｔｔｐｓ: / / ｐｈｙｔｏｚｏｍｅ. ｊｇｉ. ｄｏｅ. ｇｏｖ )ꎮ 采 用 ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ

指标和分子试验观测ꎮ (ｖ２. ２. １ ) 计 算 基 因 表 达 量 ＦＰＫＭ 值ꎬ ＤＥＳｅｑ２
Ｂ(人工模拟低温条件结合需冷量测定时样品 (ｖ１.３４.０)进行差异表达分析( ｜ ｌｏｇ Ｆｏｌｄ Ｃｈａｎｇｅ ｜ >
２
采集时间):一次性采集 １５０ 个枝条ꎬ把采集回来 １ꎬ ＦＤＲ<０.０５)ꎮ ＧＯ 功能注释与 ＫＥＧＧ 通路富集
的枝条放在 ４ ℃ 冰箱ꎬ做人工低温休眠处理ꎻ根据 分析 采 用 ｃｌｕｓｔｅｒＰｒｏｆｉｌｅｒ ( ｖ４. ２. ２) Ｒ 包 完 成 ( Ｐ <
猕猴桃的具体需冷量进行了调整ꎬ采样时间以达 ０.０５)ꎮ 实验流程参照李晓艳等(２０２０)的方法ꎮ