Page 72 - 《广西植物》2026年第5期
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８ ０ ４ 广 西 植 物 ４６ 卷
因 此 研 究 ＣＹＲＳＶ 功 能 蛋 白 对 深 入 研 究 ＣＹＲＳＶ
病毒侵染机制尤其重要ꎮ １ 材料与方法
病 毒 诱 导 的 基 因 沉 默 ( ｖｉｒｕｓ￣ｉｎｄｕｃｅｄ ｇｅｎｅ
ｓｉｌｅｎｃｉｎｇꎬＶＩＧＳ)是指将目的基因片段构建至 ＶＩＧＳ １.１ 实验材料
载体上ꎬ获得重组病毒载体ꎬ注射植株后ꎬ随着病 辣椒黄 化 环 斑 病 毒 毒 源、 本 氏 烟 ( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
毒的感染与扩散ꎬ激发植物免疫反应机制ꎬ进而实 ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ)和辣椒品种‘ 思椒’ 种子均由云南省
现对靶基因的沉默( 任恒泽等ꎬ２０２４)ꎮ ＶＩＧＳ 具备 农业科学院生物技术与种质资源研究所植物病毒
操作简便、完成高效、周期时间短、无需获取转基 团队保存提供ꎮ ｐＴＲＶ１、ｐＴＲＶ２ 载体ꎬ以及 ｐＴＲＶ２￣
因植株、高通量等优势ꎬ是研究功能基因组和特定 ＰＤＳ 沉 默 载 体 来 自 云 南 农 业 大 学 李 凡 教 授 课
题组ꎮ
基因功能的有力工具(侯巧明等ꎬ２０１５ꎻ魏正欣等ꎬ
２０２２)ꎮ ＶＩＧＳ 的沉默效率和插入片段与目的基因 １.２ Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因 ＶＩＧＳ 靶序列扩增
的同源性程度密切关联ꎮ 一般而言ꎬＶＩＧＳ 的沉默 按照本实验室扩增测序获得 ＣＹＲＳＶ Ｎ、ＮＳｓ、
ＮＳｍ 编码序列选择靠近 ５′端 ３００ ｂｐ 左右的序列作
效率和插入片段与靶基因两者的同源性越高ꎬ病
为 ＶＩＧＳ 沉默靶序列ꎬ并以同源重组的方法设计引
毒诱 导 引 发 的 基 因 沉 默 效 率 也 越 高 ( 张 丽 英ꎬ
物:ｐＴＲＶ２￣Ｎ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ 引物序列见
２０２２)ꎮ ２０１９ 年ꎬＣｈｏｉ 等人研发了基于蚕豆萎蔫
表 １ꎬ引物由生工生物工程( 上海) 股份有限公司
病毒( ｂｒｏａｄ ｂｅａｎ ｗｉｌｔ ｖｉｒｕｓꎬＢＢＷＶ) 的 ＶＩＧＳ 载体ꎬ
并在多种辣椒品种中成功抑制了 ＰＤＳ 基因ꎬ这也 合成ꎮ 以实验室保存的感染 ＣＹＲＳＶ 的番茄 ｃＤＮＡ
为模板( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２５)ꎬ应用 ２×Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔａｑ
为辣椒作物基因功能方面的研究提供了新的 ＶＩＧＳ
预混液( 湖南艾科瑞生物工程有限公司) 扩增 Ｎ、
工具(郝梦媛等ꎬ２０２２)ꎮ 目前ꎬ关于 ＣＹＲＳＶ 中 Ｎ、
ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因目的片段ꎮ ＰＣＲ 反应 体 系:２ ×
ＮＳｍ 和 ＮＳｓ 基因的 ＶＩＧＳ 体系相关研究还未见报
Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２.５ μＬ、模板 １ μＬ、引物
道ꎮ 构建 ＣＹＲＳＶ 主要功能蛋白相关沉默载体对
上下游各 ０.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ １０.５ μＬꎮ ＰＣＲ 程序:９４
深入研究 ＣＹＲＳＶ 病毒侵染机制尤其重要ꎬ本研究 ２
℃ 预变性 ３０ ｓꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓ、５６ ℃ 退火 ３０ ｓ、７２
将 ＣＹＲＳＶ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的 ３００ ｂｐ 左右靶片段
℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ３４ 个循环ꎻ７２ ℃ 最终延伸 ２ ｍｉｎꎮ
分别构建到 ｐＴＲＶ２ 沉默载体上ꎬ以农杆菌介导的
扩增产物经 １.０％琼脂糖凝胶电泳ꎬＵＶ 凝胶成像
方法注射到本氏烟和辣椒中ꎬ２ ｄ 后对本氏烟进行
系统拍照ꎮ 将扩增产物按照琼脂糖凝胶电泳回收
ＣＹＲＳＶ 摩擦接种ꎮ 注射 １２ ｄ 后采集系统叶应用
试剂盒(苏州优逸兰迪生物科技有限公司) 说明书
绝对实时荧光定量 ＰＣＲ( ｑＲＴ￣ＰＣＲ) 方法检测 Ｎ、
进行 ＤＮＡ 回收纯化ꎬ以获得目的基因ꎮ
ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的拷贝数ꎮ 本研究运用 ＶＩＧＳ 技术
１.３ Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 的 ＶＩＧＳ 载体构建及农杆菌
构建 Ｎ、ＮＳｍ 和 ＮＳｓ 基因沉默载体ꎬ可以更好地了
转化
解该病 毒 的 遗 传 结 构 与 作 用 机 制ꎬ 为 深 入 研 究 采用限制性内切酶 ＢａｍＨ Ｉ 对 ｐＴＲＶ２ 载体进
ＣＹＲＳＶ 的致病机理提供研究材料和有力依据ꎬ为
行单 酶 切ꎬ酶 切 反 应 体 系 ( 总 量 ５０ μＬ):模 板 ２
实现 ＣＹＲＳＶ 的 绿 色 防 控 提 供 理 论 依 据 和 实 验
μＬ、１０ × Ｂｕｆｆｅｒ ５ μＬ、ＢａｍＨ Ｉ １ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ４２ μＬꎮ
２
手段ꎮ 反应程序为 ３７ ℃ 孵育 ２０ ｍｉｎꎮ 将单酶切产物进
本研究 以 构 建 ＣＹＲＳＶ 的 主 要 功 能 基 因 Ｎ、 行 ＤＮＡ 纯化后测定浓度备用ꎬ保证浓度足够ꎮ 根
ＮＳｓ、ＮＳｍ 为研究对象ꎬ基于 ｐＴＲＶ 载体的 ＶＩＧＳ 体 据 ＯＫ Ｃｌｏｎ ＤＮＡ 连接试剂盒Ⅲ( 湖南艾科瑞生物
系ꎬ采用同源重组和实时荧光定量 ＰＣＲ 的方法ꎬ构 工程 有 限 公 司) 说 明 书 操 作ꎬ 用 ２. ５ × ＯＫ Ｃｌｏｎ
建了 ＣＹＲＳＶ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的 ＶＩＧＳ 体系ꎬ拟探 Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ⅱ试剂盒将目的基因与 ｐＴＲＶ２ 载体连
讨以下问题:(１)Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的 ＶＩＧＳ 体系的 接起来ꎬ反应体系( 总量 １０ μＬ):２.５ × ＯＫ Ｃｌｏｎ
靶基因片段长度ꎻ(２) Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的 ＶＩＧＳ 体 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ４ μＬ、 ｐＴＲＶ２ 载 体 ４ μＬ、 基 因 片 段 ２
系在本氏烟中的效率ꎻ(３) ＶＩＧＳ 体系和 ＣＹＲＳＶ 接 μＬꎮ 反应程序为 ５０ ℃ 反应 １０ ｍｉｎꎮ 将以上连接
种的时 间 先 后ꎻ ( ４) ＣＹＲＳＶ 侵 染 过 程 中 Ｎ、 ＮＳｓ、 产物转化到大肠杆菌 ＤＨ５α 感受态细胞中ꎬ在含
ＮＳｍ 基因的重要性ꎮ 卡那霉素抗性的 ＬＢ 平板上筛选单克隆ꎬ 将单克隆
