Page 73 - 《广西植物》2026年第5期

５ 期 李妤等: 辣椒黄化环斑病毒主要功能基因 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 的 ＶＩＧＳ 体系构建及效率验证 ８ ０ ５

表 １ 引物序列
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
引物名称 引物序列(５′－３′) 长度
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′－３′) Ｌｅｎｇｔｈ (ｂｐ)
ｐＴＲＶ２￣Ｎ￣Ｆ ＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＧＴＴＡＡＧＣＡＡＣＴＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＡＡＡＡＴＣＡ ３０７
ｐＴＲＶ２￣Ｎ￣Ｒ ＣＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＴＧＡＣＣＡＴＴＴＴＴＧＴＣＣＴＡＡＴＡＡＡＡＧＣＴ
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ￣Ｆ ＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＡＡＣＧＴＧＴＴＡＧＡＡＴＣＴＴＴＡＴＧＣＣＣＴ ３０３
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ￣Ｒ ＣＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＡＡＴＣＡＴＴＴＴＴＣＣＡＡＴＴＧ
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ￣Ｆ ＡＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＡＡＣＧＡＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＡＴＧ ３００
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ￣Ｒ ＣＧＴＧＡＧＣＴＣＧＧＴＡＣＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＡＡＧＴＡＡＣＣＣ
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮ￣Ｆ ＧＣＧＧＴＡＣＴＧＣＡＧＡＴＧＴＴＧＡＡ ２２４
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮ￣Ｒ ＧＧＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＡ
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮＳｓ￣Ｆ ＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＴ ２２５
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮＳｓ￣Ｒ ＧＣＣＣＡＴＧＡＣＡＧＡＧＡＡＡＣＣＡＴ
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮＳｍ￣Ｆ ＧＣＴＧＴＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＴＣＴＧＡ １９８
ＣＹＲＳＶ￣ｑＮＳｍ￣Ｒ ＧＧＴＣＧＧＧＡＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＴＡ

进行菌落 ＰＣＲ 鉴定ꎬ最后将 ＰＣＲ 阳性克隆菌液送 状况良好适合的本氏烟和辣椒叶片)ꎬ用左手食指
生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序ꎬ经序列 轻轻抵住上表皮ꎬ将针筒对准针眼孔缓慢注射ꎬ侵
® 染液 进 入 叶 片 的 四 分 之 一 即 可ꎮ 摩 擦 接 种
比对分析ꎬ测序正确的阳性克隆菌液按照 Ｔｒｅｌｉｅｆ
Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ 高纯度质粒小提试剂盒进行 ＣＹＲＳＶ:先将研钵放在冰上ꎬ再将 ＣＹＲＳＶ 毒源从－
质粒提取ꎬ最终获得的重组载体质粒为 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、 ８０ ℃ 冰箱中取出ꎬ加入适量 ＰＢＳ 缓冲液ꎬ在研钵
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍꎮ 将重 组 质 粒 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、 中研磨碎后用金刚砂和棉签摩擦接种 ＣＹＲＳＶꎬ随
ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ 通过液氮速溶法转入 农 后在温室中继续培养ꎮ 组别设置如下:ｐＴＲＶ２ 组
杆菌 ＧＶ３１０１ 感 受 态 细 胞 中ꎬ 在 卡 那 霉 素 ( １００ (注射 ＶＩＧＳ 空体系菌液并接种 ＣＹＲＳＶꎬ注射顺序
ｍｇＬ )和利福平(５０ ｍｇＬ ) 的抗性条件下筛 与对应目标基因 ＶＩＧＳ 体系一致)ꎻＣＹＲＳＶ ２ ｄ ＋
￣１
￣１
选阳性菌ꎮ 用 ＰＣＲ 扩增引物进行菌液 ＰＣＲ 验证ꎬ ｐＴＲＶ２￣Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣１０ ｄ 组(ＣＹＲＳＶ 接种 ２ ｄ 后注
有目的条带的阳性克隆菌液为 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、ｐＴＲＶ２￣ 射 Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣ＶＩＧＳ 体系ꎬ１０ ｄ 后取样)ꎻＣＹＲＳＶ＋
ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ 重组载体农杆菌菌液ꎮ ｐＴＲＶ２￣Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣１０ ｄ 组 ( ＣＹＲＳＶ 接 种 后 马 上
１.４ ＶＩＧＳ 载体农杆菌注射及 ＣＹＲＳＶ 接种方法 注 射 Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣ＶＩＧＳ 体 系ꎬ １０ ｄ 后 取 样 )ꎻ
侵染液配制:５０ ｍＬ 灭菌水、５０ μＬ ＡＳ、２５ μＬ ｐＴＲＶ２￣Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣２ ｄ＋ ＣＹＲＳＶ １０ ｄ 组( Ｎ / ＮＳｓ/
￣１ ＮＳｍ￣ＶＩＧＳ 体系注射 ２ ｄ 后接种 ＣＹＲＳＶꎬ１０ ｄ 后取
ＭＥＳ、５００ μＬ ＭｇＣｌ ꎮ 将摇匀的菌液以 ５ ０００ ｒｍｉｎ
２
转速离心 １０ ｍｉｎꎬ弃上清液ꎮ 在常温下ꎬ３ ０００ × ｇ 离 样)ꎻｐＴＲＶ２￣Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣５ ｄ＋ ＣＹＲＳＶ １０ ｄ 组( Ｎ /
心 收 集 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、 ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、 ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ、 ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣ＶＩＧＳ 体系注射 ５ ｄ 后接种 ＣＹＲＳＶꎬ１０ ｄ
ｐＴＲＶ２￣ＰＤＳ、ｐＴＲＶ１ 及 ｐＴＲＶ２ 载体菌体ꎬ使用适量 后取样)ꎻｐＴＲＶ２￣Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣８ ｄ＋ ＣＹＲＳＶ １０ ｄ 组
的侵染液分别悬浮适量的菌沉淀ꎬ分光光度计测 (Ｎ / ＮＳｓ/ ＮＳｍ￣ＶＩＧＳ 体系注射 ８ ｄ 后接种 ＣＹＲＳＶꎬ
ＯＤ 值ꎬ保证菌液 ＯＤ 值为 ０.６ ~ １.０ꎬ２８ ℃ 恒温培养 １０ ｄ 后取样)ꎻ每组包含 ３ 株本氏烟或辣椒ꎬ实验
箱避光静置 ６ ~ ８ ｈ 待用ꎮ 浸染注射:分别将载体 重复 ３ 次ꎮ 同时ꎬ设置 ｐＴＲＶ１ / ｐＴＲＶ２￣ＰＤＳ 菌液注
ｐＴＲＶ２￣Ｎ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ、ｐＴＲＶ２￣ＰＤＳ 以 射的本氏烟作为指示对照ꎮ
及 ｐＴＲＶ２ 的侵染液与 ｐＴＲＶ１ 侵染液按 １ ∶ １ 的体 １.５ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 绝对实时荧光定量 ＰＣＲ 标准曲
积比充分混匀ꎬ使用 １ ｍＬ 注射器吸满侵染液ꎬ利 线的建立
用针头轻柔地戳待注射叶片的下表皮( 选择生长 Ｐｉｍｅｒ ３.０ Ｐｌｕｓ 在线设计 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 的实时